Name: real-time fluorescent measurement of synaptic functions in models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-07-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende de nuværende og tidligere medlemmer af Jefferson Weinberg ALS Center for kritisk feedback og forslag til optimering af disse teknikker og deres analyser. Dette arbejde blev støttet af finansiering fra NIH (RF1-AG057882-01 og R21-NS0103118 til D.T.), NINDS (R56-NS092572 og R01-NS109150 til P.P),Muscular Dystrophy Association (D.T.), Robert Packard Center for ALS Research (D.T.), Family Strong 4 ALS Foundation og Farber Family Foundation (B.K.J., K.K. og P.P.).

Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Jefferson University.
1. Primær kultur af neuroner fra embryonal rottecortex
BEMÆRK: Primære kortikale neuroner isoleres fra E17.5 rotteembryoner som tidligere beskrevet57,58. Ingen stamme bias synes at eksistere med succesen med denne dyrkningsprotokol. Denne metode er beskrevet kort nedenfor. De...

Tre trin, der er fælles for begge beskrevne metoder, er af afgørende betydning for eksperimentel succes og kvantificerbare resultater. For det første er forberedelse af frisk aCSF før hver runde af eksperimenter afgørende efter vedlagte instruktioner. Undladelse af at gøre dette kan forhindre passende neuronal depolarisering. En prøve af ubehandlede kontrolneuroner bør konstant testes før stimulering af eksperimentelle grupper for at sikre korrekt cellulær depolarisering og give et benchmark for positive result...

Modellering af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) i laboratoriet gøres unikt udfordrende på grund af den overvældende sporadiske karakter af over 80% af tilfældene1 kombineret med det store antal genetiske mutationer, der vides at være sygdomsfremkaldende2. På trods af dette deler alle tilfælde af ALS det samlende træk, at der før direkte neuronal degeneration er dysfunktionel kommunikation mellem præsynaptiske motorneuroner og postsynaptiske muskelceller3,4. Klinisk, når patienter mister forbindelsen mellem de resterende øvre og nedre motorneuroner, præsenterer de med træk ved neuronal hyper- og hypoexcitabilitet gennem hele sygdommen5,6,7,8,9, hvilket afspejler komplekse underliggende molekylære ændringer i disse synapser, som vi som ALS-forskere søger at forstå.
Flere transgene modeller har illustreret, at forringelse og desorganisering af det neuromuskulære kryds forekommer med ekspression af ALS-forårsagende genetiske mutationer, herunder SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 og TDP4317,18,19 gennem morfologiske vurderinger, herunder evaluering af synaptiske boutoner, rygsøjletætheder og præ/postsynaptisk organisation. Mekanisk har det siden Coles, Hodgkins og Huxleys skelsættende papirer i 1930'erne også været muligt at evaluere synaptiske responser gennem elektrofysiologiske teknikker i enten in vitro-cellekultur eller vævsskivepræparater20. Gennem disse strategier har mange modeller af ALS vist synaptiske transmissionsunderskud. For eksempel forårsager en mutant variant af TDP43 forbedret affyringsfrekvens og reducerer aktionspotentialetærsklen i NSC-34 (rygmarv x neuroblastom hybrid cellelinje 34) motorneuronlignende celler21. Den samme variant forårsager også dysfunktionel synaptisk transmission ved det neuromuskulære kryds (NMJ) før begyndelsen af adfærdsmæssige motoriske underskud i en musemodel22. Det er tidligere blevet påvist, at mutant FUS-ekspression resulterer i reduceret synaptisk transmission ved NMJ i en drosophila-model af FUS-ALS før lokomotoriske defekter11. En nylig rapport ved hjælp af inducerede pluripotente stamceller afledt af C9orf72-ekspansionsbærere afslørede en reduktion i den let releasable pulje af synaptiske vesikler23. Alt i alt fremhæver disse undersøgelser og andre vigtigheden af at opbygge en mere omfattende forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for synaptisk signalering i sygdomsrelevante modeller af ALS. Dette vil være afgørende for at forstå ALS patobiologi og udvikle potentielle terapeutiske mål for patienter.
Metoder til strøm- og spændingsklemmeceller har været uvurderlige til bestemmelse af membranegenskaber såsom konduktans, hvilemembranpotentiale og kvantalt indhold af individuelle synapser20,24. En af de væsentlige begrænsninger ved elektrofysiologi er imidlertid, at det er teknisk udfordrende og kun giver indsigt fra en enkelt neuron ad gangen. Levende celle konfokal mikroskopi kombineret med specifikke fluorescerende sonder giver mulighed for at undersøge den synaptiske transmission af neuroner på en spatiotemporal måde25,26,27. Selvom det ikke er et direkte mål for neuronal excitabilitet, kan denne fluorescensmetode give en relativ måling af to molekylære korrelationer af synaptisk funktion: synaptisk vesikelfrigivelse og calciumtransienter ved synaptiske terminaler.
Når et handlingspotentiale når den præsynaptiske terminalregion af neuroner, udløses calciumtransienter, hvilket letter overgangen fra et elektrisk signal til processen med frigivelse af neurotransmitter28. Spændingsgated calciumkanaler lokaliseret til disse områder regulerer calciumsignalering tæt for at modulere kinetikken af neurotransmitterfrigivelse29. De første rapporterede fluorescensbaserede optagelser af calciumtransienter blev udført ved anvendelse af enten dobbeltbølgelængdeindikatoren Fura-2 AM eller det enkelte bølgelængdefarvestof Fluo-3 AM30,31,32. Mens disse farvestoffer gav stor ny indsigt på det tidspunkt, lider de af flere begrænsninger såsom ikke-specifik opdeling i celler, aktivt eller passivt farvestoftab fra mærkede celler, fotoblegelse og toksicitet, hvis de afbildes over længere tid33. I det sidste årti er genetisk kodede calciumindikatorer blevet arbejdsheste til billeddannelse af forskellige former for neuronal aktivitet. Disse indikatorer kombinerer et modificeret fluorescerende protein med et calciumchelatorprotein, der hurtigt skifter fluorescensintensitet efter bindingen af Ca2+ ioner34. Anvendelsen af disse nye indikatorer er enorm, hvilket giver mulighed for meget lettere visualisering af intracellulære calciumtransienter både in vitro- og in vivo-indstillinger. En familie af disse genetisk kodede journalister, kendt som GCaMP, bruges nu bredt. Disse indikatorer indeholder et C-terminalt calmodulindomæne efterfulgt af grønt fluorescerende protein (GFP) og er dækket af et N-terminalt calmodulinbindende område35,36. Calciumbinding til calmodulindomænet udløser en interaktion med det calmodulinbindende område, hvilket resulterer i en konformationsændring i den samlede proteinstruktur og en betydelig stigning i fluorescensen af GFP-moiety35,36. I årenes løb har denne familie af journalister gennemgået flere udviklinger for at muliggøre forskellige udlæsninger for bestemte calciumtransienter med specifik kinetik (langsom, medium og hurtig), hver med lidt forskellige egenskaber37,38. Her er brugen af reporteren GcaMP6 blevet fremhævet, som tidligere har vist sig at detektere enkeltaktionspotentialer og dendritiske calciumtransienter i neuroner både in vivo og in vitro37.
Calciumtransienter i den præsynaptiske region udløser synaptiske vesikelfusionshændelser, hvilket forårsager frigivelse af neurotransmitter i synapsen og initiering af signalhændelser i den postsynaptiske celle28,39. Synaptiske vesikler frigives og genanvendes både hurtigt, da cellen homeostatisk opretholder et stabilt cellemembranoverfladeareal og let releasable pool af fusionsdygtige membranbundne vesikler40. Det her anvendte styrylfarvestof har en affinitet over for lipidmembraner og ændrer specifikt dets emissionsegenskaber baseret på rækkefølgen af det omgivende lipidmiljø41,42. Det er således et ideelt værktøj til mærkning af genbrug af synaptiske vesikler og efterfølgende sporing af disse vesikler, da de senere frigives efter neuronal stimulering41,42. Protokollen, der er genereret og optimeret, er en tilpasning af de begreber, der oprindeligt blev beskrevet af Gaffield og kolleger, hvilket giver os mulighed for kontinuerligt at visualisere styrylfarvestofmærket synaptisk vesicle puncta over tid41.
Her beskrives to relaterede fluorescensbaserede metoder, der pålideligt rapporterer specifikke cellulære hændelser involveret i synaptisk transmission. Protokoller er blevet defineret for at undersøge dynamikken i depolariseringsmedieret præsynaptisk terminal calciumtilstrømning og synaptisk vesikelekocytose i dyrkede neuroner. Her er metoder og repræsentative resultater fokuseret på at bruge primære gnaverkortikale eller motorneuroner som in vitro-modelsystem, da der er offentliggjort undersøgelser ved hjælp af disse celletyper43,44. Disse metoder er dog også anvendelige på differentierede humane i3 kortikale neuroner45, da vi også har haft succes med begge protokoller i igangværende eksperimenter i vores laboratorium. Den generelle protokol er skitseret i et trinvist lineært format, vist i figur 1. Kort sagt, for at studere calciumdynamik i neuritter transfekter transfekteres modne neuroner med plasmid-DNA for at udtrykke den fluorescerende reporter GCaMP6m under en Cytomegalovirus (CMV) promotor37,46. Transfekterede celler har et lavt niveau af basal grøn fluorescens, hvilket stiger i nærvær af calcium. Regioner af interesse er specificeret til at overvåge fluorescensændringer under hele vores manipulation. Dette gør det muligt at måle stærkt rumligt og tidsmæssigt lokaliserede udsving i calcium37,46. Til evaluering af synaptisk vesikelfusion og frigivelse er modne neuroner fyldt med styrylfarvestof inkorporeret i synaptiske vesikkelmembraner, når de genbruges, reformeres og genindlæses med neurotransmittere i præsynaptiske celler41,42,43,47,48. De nuværende farvestoffer, der anvendes til dette formål, mærker synaptiske vesikler langs neuritter og anvendes som proxy for disse regioner i levende billeddannelsesforsøg, som det blev vist ved co-farvning af styrylfarvestof og synaptotagmin af Kraszewski og kolleger49. Inkluderet her er repræsentative billeder af lignende farvning, der også er udført (figur 2A). Tidligere efterforskere har i vid udstrækning brugt sådanne farvestoffer til at rapportere synaptisk vesikeldynamik ved det neuromuskulære kryds og hippocampale neuroner48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Ved at vælge punkterede områder af farvestofbelastede vesikler og ved at overvåge fald i fluorescensintensiteten efter vesikelfrigivelse kan funktionel synaptisk transmissionskapacitet og tidsmæssig dynamik i frigivelsen undersøges efter stimulering43. Til begge metoder anvendes et medium indeholdende en høj koncentration af kaliumchlorid til at depolarisere celler for at efterligne neuronal aktivitet. Billeddannelsesparametre er specificeret til at fange intervaller på under et sekund, der spænder over en baseline normalisering efterfulgt af vores stimuleringsoptagelsesperiode. Fluorescensmålinger på hvert tidspunkt bestemmes, normaliseres til baggrunden og kvantificeres over den eksperimentelle tidsperiode. Calcium-tilstrømning medieret GCaMP6m fluorescensforøgelse eller effektiv synaptisk vesikel exocytose styrylfarvestof frigivelse fluorescens fald kan detekteres gennem denne strategi. Detaljeret metodologisk opsætning og parametre for disse to protokoller og en diskussion om deres fordele og begrænsninger er beskrevet nedenfor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62813/62813fig01.jpg"> Figur 1: Visuel gengivelse af den samlede generelle protokolproces. (1) Isoler og dyrkning af primære gnaverneuroner in vitro til det valgte modningstidspunkt. (2) Indfør GCaMP DNA eller styrylfarvestof som indberettere af synaptisk aktivitet. (3) Opsætning af billeddannelsesparadigme ved hjælp af konfokalmikroskop med levende billeddannelse og tilhørende software. Begynd den oprindelige optagelsesperiode. (4) Mens celler stadig gennemgår live-image capture, stimuleres neuroner via høj KCl-badperfusion. (5) Vurder fluorescensintensitetsmålinger over tid for at måle calciumtransienter eller synaptisk vesikelfusion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62813/62813fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x oil immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes without Needle, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td>Part of gravity perfusion assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cell culture hood</td>
			<td>Baker</td>
			<td>SterilGARD III SG403A</td>
			<td>Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>For culturing and maintenance of neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-998-123</td>
			<td>For culturing and maintenance of neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>For neuronal culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti +A1R core</td>
			<td>For fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP ES2&#160; CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td>For neuronal culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>400SASSD</td>
			<td>For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>For imaging Gcamp calcium transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 styryl dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td>For imaging synaptic vesicle release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-10-1.5-N</td>
			<td>For growth of neurons on imaging-compatible culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>52NK56</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging. Please see recipes*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>For culturing and maintenance of neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow dissection hood</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-301-630</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td>Neuronal culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>For neuronal transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging. Please see recipes*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>208337</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analysis/normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene&#160; Filter Units, 0.2 &#181;m PES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>565-0020</td>
			<td>Filter unit for aCSF solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>For culturing and maintenance of neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software for image capture and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>For preparing neuronal culture and buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>For preparing neuronal culture and buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>To prevent bacterial contamination of neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td>For exchange of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-30526-14</td>
			<td>Part of gravity perfusion assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-Gcamp6m plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40754</td>
			<td>For imaging calcium transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7886</td>
			<td>Coating agent for glass bottom petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>For incubation of live neurons during imaging period</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>For imaging FM4-64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6414</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration Isolation table</td>
			<td>New Port</td>
			<td>VIP320X2430-135520</td>
			<td>Table/stand for microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time fluorescent measurement of synaptic functions in models of amyotrophic lateral sclerosis

Før neuronal degeneration er årsagen til motoriske og kognitive underskud hos patienter med amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og / eller frontotemporal lobe demens (FTLD) dysfunktion af kommunikation mellem neuroner og motorneuroner og muskler. Den underliggende proces med synaptisk transmission involverer membrandepolariseringsafhængig synaptisk vesikelfusion og frigivelse af neurotransmittere i synapsen. Denne proces sker gennem lokaliseret calciumtilstrømning til de præsynaptiske terminaler, hvor synaptiske vesikel befinder sig. Her beskriver protokollen fluorescensbaserede levende billeddannelsesmetoder, der pålideligt rapporterer depolariseringsmedieret synaptisk vesikelekocytose og præsynaptisk terminal calciumtilstrømningsdynamik i dyrkede neuroner.
Ved hjælp af et styrylfarvestof, der er inkorporeret i synaptiske vesikelmembraner, belyses den synaptiske vesiclefrigivelse. På den anden side anvendes Gcamp6m til at studere calciumindgang, en genetisk kodet fluorescerende reporter. Vi anvender høj kaliumchloridmedieret depolarisering til at efterligne neuronal aktivitet. For at kvantificere synaptisk vesicle exocytose entydigt måler vi tabet af normaliseret styrylfarvestoffluorescens som en funktion af tiden. Under lignende stimuleringsbetingelser øges Gcamp6m fluorescens i tilfælde af calciumtilstrømning. Normalisering og kvantificering af denne fluorescensændring udføres på samme måde som styrylfarvestofprotokollen. Disse metoder kan multiplexeres med transfektionsbaseret overekspression af fluorescerende mærkede mutante proteiner. Disse protokoller er blevet flittigt brugt til at studere synaptisk dysfunktion i modeller af FUS-ALS og C9ORF72-ALS, ved hjælp af primære gnaverkortikale og motorneuroner. Disse protokoller giver let mulighed for hurtig screening af forbindelser, der kan forbedre neuronal kommunikation. Som sådan er disse metoder værdifulde ikke kun for undersøgelsen af ALS, men for alle områder af neurodegenerativ og udviklingsmæssig neurovidenskabelig forskning.

Efter den vellykkede implementering af ovennævnte protokol vises repræsentative resultater for et typisk styrylfarvestofsynaptisk vesikelfrigivelseseksperiment. Dyrkede rotte primære kortikale neuroner blev fyldt med farvestof ved hjælp af metoden beskrevet i afsnit 6. Specificiteten af farvestofbelastning blev bestemt ved co-mærkning med synaptisk vesikelmarkør synaptophysin. Et flertal af styrylfarvestof positiv puncta er co-positive for denne markør (figur 2A). For at afgøre, om d...

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

To relaterede metoder er beskrevet for at visualisere subcellulære hændelser, der kræves til synaptisk transmission. Disse protokoller muliggør realtidsovervågning af dynamikken i præsynaptisk calciumtilstrømning og synaptisk vesikelmembranfusion ved hjælp af levende cellebilleddannelse af in vitro-dyrkede neuroner.

Fluorescerende måling i realtid af synaptiske funktioner i modeller af amyotrofisk lateral sklerose

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Disse metoder muliggør hurtig vurdering af, om en eksperimentel manipulation, sygdomsfremkaldende protein eller RNA kan påvirke synaptiske processer, og om terapeutiske forbindelser kan genoprette funktionen. Disse teknikker giver en pålidelig aflæsning af synaptisk funktion fra en gruppe neuroner på relativt kort tid sammenlignet med elektrofysiologi. Denne protokol kan anvendes på enhver sygdom med neuronal udvikling eller degeneration.Dette fungerer godt for primære gnaverneuronale kulturer og for neuroner afledt af inducerede pluripotente stamceller. Til at begynde med skal du optimere indstillingerne for billedoptagelse ved hjælp af konfokal billedoptagelsessoftware. Hold eksponeringstiden for excitationseffekt, detektorforstærkning og billedhastighed konstant på tværs af alle prøver.For timelapse-billeddannelse skal du vælge et billedformat på 512 x 512 og en billedhastighed på to billeder i sekundet for at minimere farveblegning. Vælg derefter kombinationerne fluorescensexcitation, dichroic og emissionsfilter for GCaMP seks M / GCaMP tre med Fitzy og stearoylfarvestof med Trixi. For at undgå Z-drift under tidsforløbsbilleddannelse skal du bruge den perfekte fokusfunktion i softwaren til erhvervelse af konfokal billeddannelse.Vælg derefter tidsfanen i panelet til billedoptagelse. For fase et skal du indstille intervallet 500 millisekunder og varighed tre til fem minutter. Og for fase to skal du indstille interval 500 millisekunder og varighed, fem minutter.For derefter at samle tyngdekraftsperfusionsapparatet til kunstig cerebrospinalvæske eller ACSF skal du lægge ACSF-bufferen med højt kaliumchlorid i en 50 ml sprøjte øverst på apparatet og indstille strømningshastigheden til en milliliter pr. Minut. Læg derefter en 35 ml glasskål indeholdende neuroner på det konfokale billeddannelsestrin med enden af perfusionsslangen placeret ved skålkanten og vælg feltet til billeddannelse. 48 timer efter transfektion inkuberes de primære kortikale eller motorneuroner i ACSF-buffer med lavt kaliumchlorid i 10 minutter ved 37 grader Celsius.Fjern derefter bufferen ved aspiration, og ved hjælp af en pipette lægges neuronerne i mørket på en glasbund Petriskål fyldt med ACSF indeholdende 50 millimolært kaliumchlorid og 10 mikromolært styrylfarvestof. Efter fem minutter skal du fjerne belastningsopløsningen og bade neuronerne i ACSF-buffer med lavt kaliumchlorid ved 37 grader Celsius i 10 minutter for at eliminere den uspecifikke farvestofbelastning. Placer derefter skålen på billeddannelsestrinnet i det omvendte konfokale mikroskop og observer cellerne under et 20 gange luftmål eller 40 gange olienedsænkningsmål.Excite stålfarvestoffet ved hjælp af en 546 nanometer laser og opsaml emission ved hjælp af et 570 til 620 nanometer båndpasfilter. Når du har valgt billedfeltet og engageret perfekt fokus, skal du tage et enkelt stillbillede med lyse felt-, Trixi- og fluorescensmarkørkanaler for at markere neuronale grænser. Start derefter Run Now i anskaffelsessoftwaren, og udfør den basale optagelse i tre til fem minutter for at udelukke variationer i farveintensiteten.Lige ved kontakten til fase to skal du udløse tænd-knappen til perfusionssystemet og konstant perfuse 50 millimolært kaliumchlorid til neuronerne for at lette aflæsning af farvestoffer. Udfør optagelserne i fem minutter, og udløs derefter sluk-kontakten for perfusionssystemet. Gem eksperimentet til dataanalyse senere ved hjælp af den konfokale software.48 timer efter transfektion med GCaMP seks M, inkuber de primære gnaverkortikale neuroner med lavt kaliumchlorid ACSF i 15 minutter. Monter derefter fadet på billedbehandlingsplatformen og visualiseret GCaMP seks M fluorescens ved hjælp af et Fitzy-filter og et 20 gange eller 40 gange objektivt. Når du har valgt billedfeltet og engageret perfekt fokus, skal du tage et enkelt stillbillede med brightfield-, Fitzy- og fluorescensmarkørkanaler for at markere neuronale grænser.Start derefter Kør nu i erhvervelsessoftwaren og udfør den basale optagelse i tre til fem minutter. Derefter perfuser ACSF indeholdende 50 millimolært kaliumchlorid til neuronerne som tidligere påvist og optag i fem minutter. Når billedoptagelsen stopper, skal du gemme eksperimentet og fortsætte til dataanalyse ved hjælp af den konfokale software.Til billedanalyse skal du åbne timelapse-billederne i den konfokale software og justere billederne ved at klikke på Billede efterfulgt af behandling efterfulgt af juster det aktuelle dokument og derefter vælge Juster til den første ramme. Vælg områder af interesse langs neuritterne ved hjælp af ROI-udvælgelsesværktøjet, og markér også et INVESTERINGSAFKAST, der repræsenterer baggrundsfluorescensintensitet. Start derefter målefunktionen fra tidsmålingspanelet for at måle rå fluorescens over tid for de valgte ROI'er.Efter måling eksporteres de rå fluorescensintensiteter til regnearkssoftwaren. Dyrkede rotte primære kortikale neuroner fyldt med styrylfarvestof er vist her. Specificiteten af farvestofbelastning blev bestemt ved co-mærkning med synaptisk vesikelmarkør synaptophysin, og størstedelen af sterilt farvestof positivt puncta er co-positive for denne markør.Analysen af de rå intensitetsværdier over hele billeddannelsesperioden afslører, at synaptophysin og intensitet forbliver konstant, mens styrylfarvestofintensiteten falder efter stimulering. For grønne fluorescerende proteintransfekterede kontrolneuroner resulterede vellykket synaptisk vesikelfrigivelse i det slående tab af farvestoffluorescens ved høj kaliumchloriddepolarisering. Denne repræsentative video viser en neuron, der selektivt losser styrylfarvestof i en ny højre region efter stimulering.I modsætning hertil er nedsat synaptisk transmission i neuroner transfekteret med en C ni ORF 72 bundet til farvestofpeptidgentagelseskonstruktion til GA 50 repræsenteret ved tilbageholdt farvestoffluorescens, selv efter depolarisering af højt kaliumchlorid. Repræsentative fluorescensbilleder af kortikale neuroner transfekteret med GCaMP seks M før og efter depolarisering af kaliumchlorid er vist her. Øgede fluorescensværdier og kortikale neuroner transfekteret med GCaMP seks M indikerer calciumindgang til neuritter efter kaliumchloridinduceret depolarisering.I slutningen af baseline-optagelsesperioden udtrykte neuronerne GCaMP seks M med en lav fluorescens. En dramatisk fluorescensforøgelse observeres derefter i starten af stimuleringen. Sørg for, at fluorescens baseline optagelser for styrylfarvestof og GCaMP er stabile.Brug altid perfekt fokus for at undgå billeddrift, hvilket ville gøre databehandling efter billedet udfordrende. Yderligere dyrkning af neuroner anbefales ikke, da retter udsættes for luft under overflod. Imidlertid kan immunfarvning eller ekstraktion af protein eller RNA vurdere potentielle årsager til synaptiske ændringer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Lateral Diffusion og exocytose af membranproteiner i dyrkede neuroner vurderes ved hjælp af Fluorescens Recovery og Fluorescens-tab fotoblegning

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Samtidig Elektroencefalografi, Real-time måling af laktat Koncentration og Optogenetic Manipulation af neuronale aktivitet i Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Real-time Imaging af axonal Transport af Quantum Dot-mærket BDNF i Primary neuroner

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

En protokol til Administration af Real-Time fMRI Neurofeedback træning

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Live-celle måling af lugtstof Receptor aktivering ved hjælp af en Real-time lejr Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Ved at kombinere Optogenetics med kunstige MicroRNA at karakterisere effekter af genet Knockdown på præsynaptiske funktion inden for intakt Neuronal kredsløb

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Real-time i Vitro overvågning af lugtstof Receptor aktivering af en lugtstof i fasen for damp

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Omfattende obduktions program for personer med multipel sklerose

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Enkelt synapse indikatorer for glutamat frigivelse og optagelse i akut hjerne skiver fra normal og Huntington Mus

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Brug af kapillær elektroforese Immunoassay at søge efter potentielle biomarkører for amyotrofisk lateral sklerose i humane blodplader

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...