Name: real-time fluorescent measurement of synaptic functions in models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-07-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Gostaríamos de reconhecer os atuais e antigos membros do Jefferson Weinberg ALS Center para feedback crítico e sugestões para otimizar essas técnicas e suas análises. Este trabalho foi apoiado por financiamento do NIH (RF1-AG057882-01 e R21-NS0103118 para D.T), o NINDS (R56-NS092572 e R01-NS109150 a P.P), a Associação de Distrofia Muscular (D.T.), o Centro Robert Packard de Pesquisa da ALS (D.T.), a Fundação Família Strong 4 ALS e a Fundação Da Família Farber (B.K.J., K.K.K, e P.P).

Todos os procedimentos animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Jefferson.
1. Cultura primária de neurônios a partir de córtex de rato embrionário
NOTA: Os neurônios corticais primários são isolados dos embriões de ratos E17,5 como descrito anteriormente57,58. Nenhum viés de tensão parece existir com o sucesso deste pro...

Três passos comuns a ambos os métodos descritos são de importância crucial para o sucesso experimental e resultados quantificáveis. Primeiro, a preparação de um novo ACSF antes de cada rodada de experimentos é essencial, seguindo as instruções anexadas. Caso contrário, pode evitar a despolarização neuronal adequada. Uma amostra de neurônios de controle não tratados deve ser constantemente testada antes da estimulação de quaisquer grupos experimentais para garantir a despolarização celular adequada e fo...

A modelagem da esclerose lateral amiotrófica (ELA) em laboratório é feita de forma singularmente desafiadora devido à natureza esmagadoramente esporádica de mais de 80% dos casos1, juntamente com o grande número de mutações genéticas conhecidas como causagens da doença2. Apesar disso, todos os casos de ELA compartilham a característica unificadora de que antes da degeneração neuronal total, há comunicação disfuncional entre neurônios motores pré-sinápticos e células musculares postsináspticas3,4. Clinicamente, à medida que os pacientes perdem a conectividade dos neurônios motores superiores e inferiores restantes, eles apresentam características de hiperexcitabilidade neuronal ao longo da doença5,6,7,8,9, refletindo complexas mudanças moleculares subjacentes a essas sinapses, que nós, como pesquisadores da ALS, buscamos entender.
Múltiplos modelos transgênicos ilustraram que a deterioração e a desorganização da junção neuromuscular ocorrem com a expressão de mutações genéticas causagens causal da ELA, incluindo SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 e TDP4317,18,19 através de avaliações morfológicas, incluindo avaliação de boutons sinápticos, densidades da coluna vertebral e organização pré/postiática. Mecanicamente, desde os trabalhos marcantes de Cole, Hodgkin e Huxley na década de 1930, também foi possível avaliar respostas sinápticas através de técnicas eletrofisiológicas na cultura celular in vitro ou preparações de fatias de tecido20. Por meio dessas estratégias, muitos modelos de ELA têm demonstrado déficits de transmissão sináptica. Por exemplo, uma variante mutante do TDP43 causa maior frequência de disparo e diminui o limiar potencial de ação em NSC-34 (medula espinhal x neuroblastoma célula híbrida linha 34) células semelhantes a neurônios motores21. Esta mesma variante também causa transmissão sináptica disfuncional na junção neuromuscular (NMJ) antes do início de déficits motores comportamentais em um modelo de mouse22. Foi mostrado anteriormente que a expressão de FUS mutante resulta em transmissão sináptica reduzida no NMJ em um modelo de drosophila de FUS-ALS antes de defeitos locomotor11. Um relatório recente usando células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de portadores de expansão C9orf72 revelou uma redução no pool facilmente liberado de vesículas sináptica23. Ao todo, esses estudos e outros destacam a importância de construir uma compreensão mais abrangente dos mecanismos subjacentes à sinalização sináptica em modelos relevantes para doenças da ELA. Isso será fundamental na compreensão da trajetória da ELA e no desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos para os pacientes.
Métodos de células de fixação de corrente e tensão têm sido inestimáveis na determinação de propriedades de membrana, como conduance, potencial de membrana de repouso e teor de sinapses individuais20,24. No entanto, uma das limitações significativas da eletrofisiologia é que ela é tecnicamente desafiadora e só fornece insights de um único neurônio de cada vez. A microscopia confocal de células vivas, juntamente com sondas fluorescentes específicas, oferece a oportunidade de investigar a transmissão sináptica de neurônios de forma espesso25,26,27. Embora não seja uma medida direta de excitabilidade neuronal, essa abordagem de fluorescência pode fornecer uma medição relativa de duas correlações moleculares da função sináptica: liberação de vesícula sináptica e transitórios de cálcio em terminais sinápticos.
Quando um potencial de ação atinge a região terminal pré-sináptica dos neurônios, os transitórios de cálcio são acionados, facilitando a transição de um sinal elétrico para o processo de liberação de neurotransmissores28. Canais de cálcio fechados de tensão localizados nessas áreas regulam fortemente a sinalização de cálcio para modular a cinética da liberação de neurotransmissores29. As primeiras gravações relatadas baseadas em fluorescência de transitórios de cálcio foram realizadas utilizando-se o indicador de comprimento de onda dupla Fura-2 AM ou o único corante de comprimento de onda Fluo-3 AM30,31,32. Embora esses corantes tenham oferecido uma nova visão na época, eles sofrem de várias limitações, como compartimentação não específica dentro das células, perda de corante ativo ou passivo de células rotuladas, fotobleaching e toxicidade se imagens por longos períodos de tempo33. Na última década, indicadores de cálcio geneticamente codificados tornaram-se os cavalos de trabalho para a imagem de várias formas de atividade neuronal. Esses indicadores combinam uma proteína fluorescente modificada com uma proteína querador de cálcio que muda rapidamente a intensidade da fluorescência após a ligação de íons ca2+34. A aplicação desses novos indicadores é vasta, permitindo uma visualização muito mais fácil de transintes intracelulares de cálcio tanto em configurações in vitro quanto in vivo. Uma família desses repórteres geneticamente codificados, conhecido como GCaMP, agora são amplamente utilizados. Esses indicadores contêm domínio de calmodulina terminal C, seguidos de proteína fluorescente verde (GFP), e são limitados por uma região de ligação de autodulina terminal N35,36. A ligação de cálcio ao domínio calmodulin desencadeia uma interação com a região de ligação de calmodulin, resultando em uma mudança conformacional na estrutura geral da proteína e um aumento substancial na fluorescência da moiety35,36 gfp. Ao longo dos anos, essa família de repórteres passou por várias evoluções para permitir leituras distintas para transitórios de cálcio específicos com cinética específica (lenta, média e rápida), cada uma com propriedades ligeiramente diferentes37,38. Aqui, foi destacado o uso do repórter GcaMP6, que já foi demonstrado anteriormente para detectar potenciais de ação única e transitórios de cálcio dendráticos em neurônios tanto in vivo quanto in vitro37.
Transitórios de cálcio na região pré-sináptica desencadeiam eventos de fusão de vesícula sináptica, causando liberação de neurotransmissores na sinapse e início de eventos de sinalização na célula postsinásptica28,39. As vesículas sinápticas são rapidamente liberadas e recicladas, já que a célula homeostaticamente mantém uma área de superfície de membrana celular estável e uma piscina prontamente liberada de vesículas ligadas à membrana 40. O corante de estirida usado aqui tem afinidade com membranas lipídicas e altera especificamente suas propriedades de emissão com base no ordenamento do ambiente lipídemo circundante41,42. Assim, é uma ferramenta ideal para rotular vesículas sinápticas de reciclagem e posterior rastreamento dessas vesículas, pois elas são posteriormente liberadas após estimulação neuronal41,42. O protocolo que foi gerado e otimizado é uma adaptação dos conceitos descritos inicialmente por Gaffield e colegas, o que nos permite visualizar puncta styryl com tinta styryl ao longo do tempo continuamente41.
Aqui, são descritas duas metodologias relacionadas baseadas em fluorescência, relatando de forma confiável eventos celulares específicos envolvidos na transmissão sináptica. Protocolos foram definidos para sondar a dinâmica do influxo de cálcio terminal pré-sináptico mediado pela despolarização e excitose de vesícula sináptica em neurônios cultivados. Aqui, métodos e resultados representativos estão focados no uso de neurônios cortical ou motor primários como o sistema de modelo in vitro, pois há estudos publicados utilizando esses tipos de células43,44. No entanto, esses métodos também são aplicáveis a neurônios humanos diferenciados como i3 cortical45, pois também tivemos sucesso com ambos os protocolos em experimentação atualmente em curso em nosso laboratório. O protocolo geral é delineado em um formato linear stepwise, mostrado na Figura 1. Resumindo, para estudar a dinâmica do cálcio em neurites, os neurônios maduros são transfectados com DNA plasmídeo para expressar o repórter fluorescente GCaMP6m sob um promotor de Cytomegalovirus (CMV)37,46. As células transfeinadas têm um baixo nível de fluorescência verde basal, o que aumenta na presença de cálcio. Regiões de interesse são especificadas para monitorar as mudanças de fluorescência ao longo de nossa manipulação. Isso permite que flutuações altamente espacial e temporalmente localizadas no cálcio sejam medidas37,46. Para avaliar a fusão e liberação de vesículas sinápticas, os neurônios maduros são carregados com corante estilístico incorporado em membranas vesículas sinápticas à medida que são reciclados, reformados e recarregados com neurotransmissores em células pré-sinápticas41,42,43,47,48. Os corantes atuais utilizados para este fim rotulam vesículas sinápticas ao longo de neurites e são usados como proxy para essas regiões em experimentos de imagem ao vivo, como foi mostrado pela co-coloração de corante e sinaptomin por Kraszewski e colegas49. Aqui estão incluídas imagens representativas de manchas semelhantes que também foram realizadas (Figura 2A). Pesquisadores anteriores usaram extensivamente tais corantes para relatar a dinâmica da vesícula sináptica na junção neuromuscular e neurônios hipocampais48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Selecionando regiões pontuadas de vesículas carregadas de corante e monitorando a diminuição da intensidade da fluorescência após a liberação da vesícula, a capacidade de transmissão sináptica funcional e a dinâmica temporal de liberação podem ser estudadas após a estimulação43. Para ambos os métodos, um meio contendo uma alta concentração de cloreto de potássio é empregado para despolarizar células para imitar a atividade neuronal. Os parâmetros de imagem são especificados para capturar intervalos sub-segundos que abrangem uma normalização da linha de base seguida pelo nosso período de captura de estimulação. As medidas de fluorescência em cada ponto de tempo são determinadas, normalizadas ao fundo e quantificadas ao longo do período experimental. O aumento da fluorescência GCaMP6m mediada por influxo de cálcio ou o aumento efetivo da excitose styísica styryl de isca de isca podem ser detectados através desta estratégia. Configuração metodológica detalhada e parâmetros para esses dois protocolos e uma discussão sobre suas vantagens e limitações são descritos abaixo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62813/62813fig01.jpg"> Figura 1: Renderização visual do processo geral de protocolo geral. (1) Isolados e cultura neurônios roedores primários in vitro ao ponto de tempo de maturação escolhido. (2) Introduzir o DNA GCaMP ou o corante de estilílico como repórteres de atividade sináptica. (3) Configuração de paradigma de imagem usando microscópio confocal equipado de imagem ao vivo e software associado. Inicie o período de gravação da linha de base. (4) Enquanto as células ainda estão em captura de imagem ao vivo, estimule os neurônios através da perfusão de banho KCl alto. (5) Avalie as medidas de intensidade de fluorescência ao longo do tempo para medir transitórios de cálcio ou fusão de vesícula sináptica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62813/62813fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x oil immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes without Needle, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td>Part of gravity perfusion assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cell culture hood</td>
			<td>Baker</td>
			<td>SterilGARD III SG403A</td>
			<td>Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>For culturing and maintenance of neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-998-123</td>
			<td>For culturing and maintenance of neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>For neuronal culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti +A1R core</td>
			<td>For fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP ES2&#160; CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td>For neuronal culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>400SASSD</td>
			<td>For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>For imaging Gcamp calcium transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 styryl dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td>For imaging synaptic vesicle release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-10-1.5-N</td>
			<td>For growth of neurons on imaging-compatible culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>52NK56</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging. Please see recipes*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>For culturing and maintenance of neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow dissection hood</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-301-630</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td>Neuronal culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>For neuronal transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging. Please see recipes*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>208337</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analysis/normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene&#160; Filter Units, 0.2 &#181;m PES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>565-0020</td>
			<td>Filter unit for aCSF solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>For culturing and maintenance of neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software for image capture and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>For preparing neuronal culture and buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>For preparing neuronal culture and buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>To prevent bacterial contamination of neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td>For exchange of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-30526-14</td>
			<td>Part of gravity perfusion assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-Gcamp6m plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40754</td>
			<td>For imaging calcium transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7886</td>
			<td>Coating agent for glass bottom petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>For incubation of live neurons during imaging period</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>For imaging FM4-64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6414</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration Isolation table</td>
			<td>New Port</td>
			<td>VIP320X2430-135520</td>
			<td>Table/stand for microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time fluorescent measurement of synaptic functions in models of amyotrophic lateral sclerosis

Antes da degeneração neuronal, a causa dos déficits motores e cognitivos em pacientes com esclerose lateral amiotrófica (ELA) e/ou demência do lobo frontotemporal (FTLD) é a disfunção da comunicação entre neurônios e neurônios motores e músculos. O processo subjacente da transmissão sináptica envolve a fusão de vesícula sináptica dependente da despolarização da membrana e a liberação de neurotransmissores na sinapse. Esse processo ocorre através do influxo localizado de cálcio nos terminais pré-sinápticos onde residem vesículas sinápticas. Aqui, o protocolo descreve metodologias de imagem ao vivo baseadas em fluorescência que relatam de forma confiável exocitose sintárquica mediada pela despolarização e dinâmicas de influxo de cálcio terminal pré-sináptico em neurônios cultivados.
Usando um corante de estilingues que é incorporado em membranas vesículas sinápticas, a liberação de vesícula sináptica é elucidada. Por outro lado, para estudar a entrada de cálcio, o Gcamp6m é usado, um repórter fluorescente geneticamente codificado. Empregamos alta despolarização mediada por cloreto de potássio para imitar a atividade neuronal. Para quantificar a exocistose de vesícula sináptica de forma inequívoca, medimos a perda de fluorescência de corante styryl normalizada em função do tempo. Em condições de estimulação semelhantes, no caso do influxo de cálcio, a fluorescência Gcamp6m aumenta. A normalização e quantificação dessa mudança de fluorescência são realizadas de forma semelhante ao protocolo de corante styryl. Esses métodos podem ser multiplexados com a superexpressão baseada em transfecção de proteínas mutantes fluorescentes marcadas. Esses protocolos têm sido amplamente utilizados para estudar disfunção sináptica em modelos de FUS-ALS e C9ORF72-ALS, utilizando neurônios cortical e motor primários. Esses protocolos permitem facilmente uma triagem rápida de compostos que podem melhorar a comunicação neuronal. Como tal, esses métodos são valiosos não apenas para o estudo da ELA, mas para todas as áreas de pesquisa neurociência neurodegenerativa e de desenvolvimento.

Após a implementação bem-sucedida do protocolo acima, os resultados representativos são mostrados para um típico experimento de liberação de vesícula styryl. Os neurônios cortical primários do rato cultivado foram carregados com corante usando o método descrito na seção 6. A especificidade do carregamento de tingimento foi determinada pela co-rotulagem com sináptica de marcador de vesícula sináptica. A maioria dos punctas positivos de corante styryl são co-positivos para este marcador (<strong class="xfi...

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Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Dois métodos relacionados são descritos para visualizar eventos subcelulares necessários para transmissão sináptica. Esses protocolos permitem o monitoramento em tempo real da dinâmica do influxo de cálcio pré-sináptico e da fusão da membrana vesícula sináptica usando imagens de células vivas de neurônios in vitro cultivados.

Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Esses métodos permitem uma avaliação rápida sobre se uma manipulação experimental, proteína causadora de doenças ou RNA podem impactar processos sinápticos e se compostos terapêuticos podem restaurar a função. Essas técnicas fornecem uma leitura confiável da função sináptica de um grupo de neurônios em um período relativamente curto de tempo em comparação com a eletrofisiologia. Este protocolo pode ser aplicado a qualquer doença de desenvolvimento neuronal ou degeneração.Isso funciona bem para culturas neuronais de roedores primários, e para neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas. Para começar, otimize as configurações de aquisição de imagens usando o software de aquisição de imagens confocal. Mantenha o tempo de exposição de energia de excitação, o ganho do detector e a taxa de quadros constantes em todas as amostras.Para imagens de lapso de tempo, selecione uma proporção de 512 por 512 e uma taxa de quadros de duas imagens por segundo para minimizar o branqueamento de corantes. Em seguida, selecione as combinações de excitação de fluorescência, dicroica e filtro de emissão para GCaMP seis M/GCaMP três com Fitzy e corante estearoyl com Trixi. Para evitar o drift Z durante a imagem de lapso de tempo, use o recurso de foco perfeito do software de aquisição de imagens confocal.Em seguida, selecione a guia de tempo no painel de aquisição de imagens. Para a fase um, defina o intervalo de 500 milissegundos e a duração de três a cinco minutos. E para a fase dois, definir intervalo de 500 milissegundos e duração, cinco minutos.Em seguida, para montar o aparelho de perfusão de gravidade para fluido cerebrospinal artificial ou ACSF, carregue o alto tampão de cloreto de potássio ACSF em uma seringa de 50 mililitros na parte superior do aparelho e defina a taxa de fluxo para um mililitro por minuto. Em seguida, carregue um prato de vidro de 35 mililitros contendo neurônios no estágio de imagem confocal com a extremidade da tubulação de perfusão colocada na borda do prato e escolha o campo para a imagem. 48 horas após a transfecção, incubar os neurônios cortical ou motor primários no tampão ACSF de cloreto de potássio baixo por 10 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, remova o tampão por aspiração e usando uma pipeta, carregue os neurônios no escuro em uma placa de Petri de fundo de vidro preenchida com ACSF contendo 50 milimolars de cloreto de potássio e 10 Micro corante de estiling molal. Após cinco minutos, remova a solução de carregamento e banhe os neurônios em baixo tampão de cloreto de potássio ACSF a 37 graus Celsius por 10 minutos para eliminar o carregamento de corante não específico. Em seguida, coloque o prato sobre o estágio de imagem do microscópio confocal invertido e observe as células sob um objetivo de 20 vezes o ar ou 40 vezes objetivo de imersão em óleo.Excite o corante de aço usando um laser de 546 nanômetros e colete emissões usando um filtro de bandpass de 570 a 620 nanômetros. Depois de selecionar o campo de imagem e engajar o foco perfeito, pegue uma única imagem parada com canais de marcadores de trixi e fluorescência para marcar limites neuronais. Em seguida, inicie o Run Now no software de aquisição e realize a gravação basal por três a cinco minutos para excluir variações na intensidade do corante.Logo na mudança para a fase dois, acione o botão on para o sistema de perfusão e perfusa constantemente 50 milimolars de cloreto de potássio para os neurônios para facilitar a descarga de corantes. Realize as gravações por cinco minutos e acione o interruptor de desligamento para o sistema de perfusão. Salve o experimento para análise de dados mais tarde usando o software confocal.48 horas após a transfecção com GCaMP seis M, incubar os neurônios cortical do roedor primário com cloreto de potássio baixo ACSF por 15 minutos. Em seguida, monte o prato na plataforma de imagem e visualizou gCaMP seis M fluorescência usando um filtro Fitzy e um objetivo de 20 vezes ou 40 vezes. Depois de selecionar o campo de imagem e engajar o foco perfeito, pegue uma única imagem parada com canais marcadores de campo brilhante, Fitzy e fluorescência para marcar limites neuronais.Em seguida, inicie o Run Now no software de aquisição e realize a gravação basal por três a cinco minutos. Em seguida, perfuse ACSF contendo 50 milimila cloreto de potássio para os neurônios como demonstrado anteriormente e gravar por cinco minutos. Quando a aquisição de imagem parar, salve o experimento e prossiga para a análise de dados usando o software confocal.Para análise de imagem, abra as imagens de lapso de tempo no software confocal e alinhe as imagens clicando em Imagem, seguido de processamento, seguido de documento atual de alinhamento e selecione Alinhar ao primeiro quadro. Selecione regiões de interesse ao longo dos neuritos usando a ferramenta de seleção do ROI e também marque um ROI representando a intensidade da fluorescência de fundo. Em seguida, inicie a função de medida a partir do painel de medição de tempo para medir a fluorescência bruta ao longo do tempo para os ROIs selecionados.Após a medição exportar as intensidades de fluorescência bruta para o software de planilha. Neurônios corticais primários de ratos cultivados carregados com corante de estilingues são mostrados aqui. A especificidade do carregamento de tingimento foi determinada pela co rotulagem com sinástia de marcador de vesícula sináptica e a maioria dos puncta positivos de corante estéril são co positivos para este marcador.A análise dos valores de intensidade bruta durante todo o período de imagem revela que a sináplofia e a intensidade permanecem constantes enquanto a intensidade do corante estilado diminui após a estimulação. Para os neurônios de controle transfectados de proteínas fluorescentes verdes, a liberação bem sucedida de vesícula sináptica resultou na perda impressionante da fluorescência de corantes após a despolarização do cloreto de potássio. Este vídeo representativo mostra um neurônio descarregando seletivamente corante de estirpe em uma nova região direita após a estimulação.Em contraste, em neurônios transfectados com um C nove ORF 72 ligado à construção de repetição de peptídeos de corante à GA 50, a transmissão sináptica prejudicada é representada por fluorescência de corante retido mesmo após alta despolarização do cloreto de potássio. Imagens representativas de fluorescência de neurônios corticais transfectadas com GCaMP seis M antes e depois da despolarização do cloreto de potássio são mostradas aqui. O aumento dos valores de fluorescência e os neurônios corticais transfeccionados com GCaMP seis M indicam entrada de cálcio em neurites após a despolarização do cloreto de potássio.No final do período de gravação da linha de base, os neurônios expressaram GCaMP seis M com baixa fluorescência. Um aumento dramático da fluorescência é então observado no início da estimulação. Certifique-se de que as gravações da linha de base da fluorescência para corante de estilingues e GCaMP estejam estáveis.Use sempre o foco perfeito para evitar a deriva da imagem, o que tornaria o processamento de dados de postagem desafiador. Não é recomendado a cultura adicional de neurônios, pois os pratos são expostos ao ar durante a profusão. No entanto, a coloração ou extração de proteínas ou RNA pode avaliar as causas potenciais de alterações sinápticas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Difusão lateral e Exocitose de proteínas de membrana em neurônios cultivados avaliada através da recuperação de fluorescência e fluorescência perda de fotobranqueamento

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Neurociência

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Imagens em tempo real de axonal Transporte de Quantum Dot marcado BDNF na Primária Neurônios

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Um protocolo para a administração do real-time fMRI treinamento de Neurofeedback

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Combinação de Optogenetics com microRNAs Artificial para caracterizar os efeitos do Gene Knockdown na função pré-sináptica dentro circuitos neuronais intacta

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Em tempo real em Vitro monitoramento da ativação do Odorant Receptor por um odorante na fase de Vapor

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Programa de autópsia abrangente para indivíduos com esclerose múltipla

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Uso de Imunoensaios de Eletroforese Capilar para Procurar Potenciais Biomarcadores de Esclerose Lateral Amiotrófica em Plaquetas Humanas

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...