Name: real-time fluorescent measurement of synaptic functions in models of amyotrophic lateral sclerosis
Uploaded: 2021-07-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a los miembros actuales y anteriores del Jefferson Weinberg ALS Center por sus comentarios críticos y sugerencias para optimizar estas técnicas y sus análisis. Este trabajo fue apoyado por fondos de los NIH (RF1-AG057882-01 y R21-NS0103118 a D.T.), el NINDS (R56-NS092572 y R01-NS109150 a P.P), la Asociación de Distrofia Muscular (D.T.), el Centro Robert Packard para la Investigación de la ELA (D.T.), la Fundación Family Strong 4 ALS y la Fundación de la Familia Farber (B.K.J., K.K y P.P).

Todos los procedimientos en animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jefferson.
1. Cultivo primario de neuronas de la corteza embrionaria de la rata
NOTA: Las neuronas corticales primarias se aíslan de embriones de rata E17.5 como se describió anteriormente57,58. No parece existir ningún sesgo de tensión con el éxit...

Tres pasos comunes a ambos métodos descritos son de crucial importancia para el éxito experimental y los resultados cuantificables. En primer lugar, la preparación de aCSF fresco antes de cada ronda de experimentos es esencial, siguiendo las instrucciones adjuntas. No hacerlo puede prevenir la despolarización neuronal adecuada. Una muestra de neuronas de control no tratadas debe analizarse constantemente antes de la estimulación de cualquier grupo experimental para garantizar una despolarización celular adecuada y ...

El modelado de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) en el laboratorio se hace excepcionalmente desafiante debido a la naturaleza abrumadoramente esporádica de más del 80% de los casos1, junto con la gran cantidad de mutaciones genéticas que se sabe que son causantes de la enfermedad2. A pesar de esto, todos los casos de ELA comparten la característica unificadora de que antes de la degeneración neuronal absoluta, existe una comunicación disfuncional entre las neuronas motoras presinápticas y las células musculares postsinápticas3,4. Clínicamente, a medida que los pacientes pierden la conectividad de las neuronas motoras superiores e inferiores restantes, se presentan con características de hiper e hipoexcitabilidad neuronal a lo largo de la enfermedad5,6,7,8,9, lo que refleja complejos cambios moleculares subyacentes a estas sinapsis, que nosotros, como investigadores de ELA, buscamos comprender.
Múltiples modelos transgénicos han ilustrado que el deterioro y la desorganización de la unión neuromuscular ocurren con la expresión de mutaciones genéticas causantes de ELA, incluyendo SOD110, FUS11,12, C9orf7213,14,15,16 y TDP4317,18,19 a través de evaluaciones morfológicas, incluida la evaluación de boutones sinápticos, densidades de la columna vertebral y organización pre / postsináptica. Mecánicamente, desde los documentos históricos de Cole, Hodgkin y Huxley en la década de 1930, también ha sido posible evaluar las respuestas sinápticas a través de técnicas electrofisiológicas en cultivo celular in vitro o preparaciones de rebanadas de tejidos20. A través de estas estrategias, muchos modelos de ELA han demostrado déficits de transmisión sináptica. Por ejemplo, una variante mutante de TDP43 provoca una mayor frecuencia de disparo y disminuye el umbral de potencial de acción en células motoras-neuronales similares a las neuronas NSC-34 (línea celular híbrida de médula espinal x neuroblastoma 34)21. Esta misma variante también causa transmisión sináptica disfuncional en la unión neuromuscular (NMJ) antes de la aparición de déficits motores conductuales en un modelo de ratón22. Anteriormente se demostró que la expresión mutante de FUS resulta en una reducción de la transmisión sináptica en el NMJ en un modelo de drosophila de FUS-ALS antes de defectos locomotores11. Un informe reciente utilizando células madre pluripotentes inducidas derivadas de portadores de expansión C9orf72 reveló una reducción en el grupo fácilmente liberable de vesículas sinápticas23. En conjunto, estos estudios y otros destacan la importancia de construir una comprensión más completa de los mecanismos subyacentes a la señalización sináptica en modelos de ELA relevantes para la enfermedad. Esto será fundamental para comprender la patobiología de la ELA y desarrollar posibles objetivos terapéuticos para los pacientes.
Los métodos de sujeción de corriente y voltaje de las células han sido invaluables para determinar las propiedades de la membrana, como la conductancia, el potencial de membrana en reposo y el contenido cuantal de las sinapsis individuales20,24. Sin embargo, una de las limitaciones significativas de la electrofisiología es que es técnicamente desafiante y solo proporciona información de una sola neurona a la vez. La microscopía confocal de células vivas, junto con sondas fluorescentes específicas, ofrece la oportunidad de investigar la transmisión sináptica de neuronas de manera espaciotemporal25,26,27. Aunque no es una medida directa de la excitabilidad neuronal, este enfoque de fluorescencia puede proporcionar una medición relativa de dos correlaciones moleculares de la función sináptica: la liberación de vesículas sinápticas y los transitorios de calcio en los terminales sinápticos.
Cuando un potencial de acción alcanza la región terminal presináptica de las neuronas, se desencadenan transitorios de calcio, facilitando la transición de una señal eléctrica al proceso de liberación de neurotransmisores28. Los canales de calcio dependientes de voltaje localizados en estas áreas regulan estrechamente la señalización de calcio para modular la cinética de la liberación de neurotransmisores29. Los primeros registros basados en fluorescencia reportados de transitorios de calcio se realizaron utilizando el indicador de longitud de onda dual Fura-2 AM o el tinte de longitud de onda única Fluo-3 AM30,31,32. Si bien estos colorantes ofrecieron una gran visión nueva en ese momento, sufren de varias limitaciones, como la compartimentación inespecífica dentro de las células, la pérdida activa o pasiva de colorantes de las células marcadas, el fotoblanqueo y la toxicidad si se toman imágenes durante largos períodos de tiempo33. En la última década, los indicadores de calcio codificados genéticamente se han convertido en los caballos de batalla para obtener imágenes de diversas formas de actividad neuronal. Estos indicadores combinan una proteína fluorescente modificada con una proteína quelante de calcio que cambia rápidamente la intensidad de la fluorescencia después de la unión de iones Ca2+34. La aplicación de estos nuevos indicadores es amplia, lo que permite una visualización mucho más fácil de los transitorios de calcio intracelulares tanto en entornos in vitro como in vivo. Una familia de estos reporteros codificados genéticamente, conocida como GCaMP, ahora se utiliza ampliamente. Estos indicadores contienen un dominio de calmodulina C-terminal, seguido de proteína fluorescente verde (GFP), y están limitados por una región de unión a calmodulina N-terminal35,36. La unión del calcio al dominio de la calmodulina desencadena una interacción con la región de unión a la calmodulina, lo que resulta en un cambio conformacional en la estructura general de la proteína y un aumento sustancial en la fluorescencia de la fracción GFP35,36. A lo largo de los años, esta familia de reporteros ha experimentado varias evoluciones para permitir lecturas distintas para transitorios de calcio particulares con cinética específica (lenta, media y rápida), cada uno con propiedades ligeramente diferentes37,38. Aquí, se ha destacado el uso del reportero GcaMP6, que previamente se ha demostrado que detecta potenciales de acción única y transitorios de calcio dendríticos en neuronas tanto in vivo como in vitro37.
Los transitorios de calcio en la región presináptica desencadenan eventos de fusión de vesículas sinápticas, causando la liberación de neurotransmisores en la sinapsis y el inicio de eventos de señalización en la célula postsináptica28,39. Las vesículas sinápticas se liberan y reciclan rápidamente, ya que la célula mantiene homeostáticamente un área de superficie de membrana celular estable y un grupo fácilmente liberable de vesículas unidas a la membrana con capacidad de fusión40. El colorante de estirilo utilizado aquí tiene una afinidad hacia las membranas lipídicas y cambia específicamente sus propiedades de emisión en función del orden del entorno lipídico circundante41,42. Por lo tanto, es una herramienta ideal para el etiquetado de vesículas sinápticas de reciclaje y el posterior seguimiento de estas vesículas a medida que se liberan posteriormente tras la estimulación neuronal41,42. El protocolo que se ha generado y optimizado es una adaptación de los conceptos descritos inicialmente por Gaffield y sus colegas, lo que nos permite visualizar la punción de vesícula sináptica marcada con colorante de estirilo a lo largo del tiempo de forma continua41.
Aquí, se describen dos metodologías relacionadas basadas en la fluorescencia, que informan de manera confiable eventos celulares específicos involucrados en la transmisión sináptica. Se han definido protocolos para sondear la dinámica de la afluencia de calcio terminal presináptico mediada por despolarización y la exocitosis de vesículas sinápticas en neuronas cultivadas. Aquí, los métodos y resultados representativos se centran en el uso de neuronas corticales o motoras primarias de roedores como sistema modelo in vitro, ya que existen estudios publicados que utilizan estos tipos de células43,44. Sin embargo, estos métodos también son aplicables a neuronas humanas i3 de tipo cortical diferenciadas45, ya que también hemos tenido éxito con ambos protocolos en la experimentación actualmente en curso en nuestro laboratorio. El protocolo general se describe en un formato lineal paso a paso, que se muestra en la Figura 1. En resumen, para estudiar la dinámica del calcio en neuritas, las neuronas maduras se transfectan con ADN plásmido para expresar el reportero fluorescente GCaMP6m bajo un promotor de citomegalovirus (CMV)37,46. Las células transfectadas tienen un bajo nivel de fluorescencia verde basal, que aumenta en presencia de calcio. Las regiones de interés se especifican para monitorear los cambios de fluorescencia a lo largo de nuestra manipulación. Esto permite medir fluctuaciones altamente localizadas espacial y temporalmente en el calcio37,46. Para evaluar la fusión y liberación de vesículas sinápticas, las neuronas maduras se cargan con colorante de estirilo incorporado en las membranas de vesículas sinápticas a medida que se reciclan, reforman y recargan con neurotransmisores en células presinápticas41,42,43,47,48. Los colorantes actuales utilizados para este propósito etiquetan vesículas sinápticas a lo largo de las neuritas y se utilizan como un proxy para estas regiones en experimentos de imágenes en vivo, como lo demostró la tinción conjunta de tinte de estirilo y sinaptotagmina por Kraszewski y sus colegas49. Aquí se incluyen imágenes representativas de tinción similar que también se han realizado (Figura 2A). Investigadores anteriores han utilizado ampliamente tales colorantes para informar la dinámica de las vesículas sinápticas en la unión neuromuscular y las neuronas del hipocampo48,49,50,51,52,53,54,55,56 . Mediante la selección de regiones punteadas de vesículas cargadas con colorante y mediante el seguimiento de las disminuciones en la intensidad de fluorescencia después de la liberación de vesículas, se puede estudiar la capacidad de transmisión sináptica funcional y la dinámica temporal de liberación después de la estimulación43. Para ambos métodos, se emplea un medio que contiene una alta concentración de cloruro de potasio para despolarizar las células para imitar la actividad neuronal. Los parámetros de imagen se especifican para capturar intervalos de menos de un segundo que abarcan una normalización basal seguida de nuestro período de captura de estimulación. Las mediciones de fluorescencia en cada punto de tiempo se determinan, normalizan en segundo plano y cuantifican durante el período de tiempo experimental. El aumento de la fluorescencia GCaMP6m mediado por la afluencia de calcio o la disminución efectiva de la exocitosis de la exocitosis de la exocitosis del colorante estirílico se pueden detectar a través de esta estrategia. A continuación se describen la configuración metodológica detallada y los parámetros para estos dos protocolos y una discusión sobre sus ventajas y limitaciones.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62813/62813fig01.jpg"> Figura 1: Representación visual del proceso general del protocolo general. (1) Aislar y cultivar neuronas primarias de roedores in vitro hasta el punto de tiempo de maduración elegido. (2) Introducir ADN GCaMP o colorante de estirilo como reporteros de la actividad sináptica. (3) Configurar el paradigma de imágenes utilizando un microscopio confocal equipado con imágenes en vivo y el software asociado. Comience el período de registro de línea de base. (4) Mientras las células todavía están experimentando la captura de imágenes en vivo, estimule las neuronas a través de una perfusión de baño de KCl alto. (5) Evaluar las mediciones de la intensidad de la fluorescencia a lo largo del tiempo para medir los transitorios de calcio o la fusión de vesículas sinápticas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62813/62813fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>20x air objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x oil immersion objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Neuronal growth supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Syringes without Needle, 50 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td>Part of gravity perfusion assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cell culture hood</td>
			<td>Baker</td>
			<td>SterilGARD III SG403A</td>
			<td>Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>For culturing and maintenance of neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9418</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>13-998-123</td>
			<td>For culturing and maintenance of neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td>For neuronal culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti +A1R core</td>
			<td>For fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolSNAP ES2&#160; CCD camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td></td>
			<td>For image acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G8270</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D5025</td>
			<td>For neuronal culture preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female, timed-pregnancy Sprague Dawley rats</td>
			<td>Charles river</td>
			<td>400SASSD</td>
			<td>For preparing embryonic cortical and spinal motor neuron cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032509</td>
			<td>For imaging Gcamp calcium transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM4-64 styryl dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T13320</td>
			<td>For imaging synaptic vesicle release</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petri dishes (Thickness #1.5)</td>
			<td>CellVis</td>
			<td>D35-10-1.5-N</td>
			<td>For growth of neurons on imaging-compatible culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>52NK56</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging. Please see recipes*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1138</td>
			<td>For culturing and maintenance of neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow dissection hood</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-301-630</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, no phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25030149</td>
			<td>Neuronal culture supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td>For neuronal transfections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low KCl artifical cerebrospinal fluid (aCSF)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For imaging. Please see recipes*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>208337</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Software for data analysis/normalization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene&#160; Filter Units, 0.2 &#181;m PES</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>565-0020</td>
			<td>Filter unit for aCSF solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>For culturing and maintenance of neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Software for image capture and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15 mL Conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td>For preparing neuronal culture and buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td>For preparing neuronal culture and buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optiprep</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>To prevent bacterial contamination of neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion system</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SF-77B</td>
			<td>For exchange of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UX-30526-14</td>
			<td>Part of gravity perfusion assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGP-CMV-Gcamp6m plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>40754</td>
			<td>For imaging calcium transients</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P7886</td>
			<td>Coating agent for glass bottom petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td>Component of aCSF solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage Top Incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>For incubation of live neurons during imaging period</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Filter cube</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>77032809</td>
			<td>For imaging FM4-64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T6414</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200056</td>
			<td>For preparing neuronal cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration Isolation table</td>
			<td>New Port</td>
			<td>VIP320X2430-135520</td>
			<td>Table/stand for microscope</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time fluorescent measurement of synaptic functions in models of amyotrophic lateral sclerosis

Antes de la degeneración neuronal, la causa de los déficits motores y cognitivos en pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y /o demencia del lóbulo frontotemporal (FTLD) es la disfunción de la comunicación entre las neuronas y las neuronas motoras y musculares. El proceso subyacente de la transmisión sináptica implica la fusión de vesículas sinápticas dependiente de la despolarización de la membrana y la liberación de neurotransmisores en la sinapsis. Este proceso ocurre a través de la afluencia localizada de calcio en los terminales presinápticos donde residen las vesículas sinápticas. Aquí, el protocolo describe metodologías de imágenes en vivo basadas en fluorescencia que informan de manera confiable la exocitosis de vesícula sináptica mediada por despolarización y la dinámica de afluencia de calcio terminal presináptica en neuronas cultivadas.
Usando un tinte de estirilo que se incorpora a las membranas de las vesículas sinápticas, se dilucida la liberación de vesículas sinápticas. Por otro lado, para estudiar la entrada de calcio, se utiliza Gcamp6m, un reportero fluorescente codificado genéticamente. Empleamos una alta despolarización mediada por cloruro de potasio para imitar la actividad neuronal. Para cuantificar la exocitosis de vesículas sinápticas sin ambigüedades, medimos la pérdida de fluorescencia normalizada del colorante de estirilo en función del tiempo. En condiciones de estimulación similares, en el caso de la afluencia de calcio, la fluorescencia de Gcamp6m aumenta. La normalización y cuantificación de este cambio de fluorescencia se realizan de manera similar al protocolo de colorante de estiril. Estos métodos se pueden multiplexar con la sobreexpresión basada en la transfección de proteínas mutantes marcadas fluorescentemente. Estos protocolos se han utilizado ampliamente para estudiar la disfunción sináptica en modelos de FUS-ALS y C9ORF72-ALS, utilizando neuronas corticales y motoras primarias de roedores. Estos protocolos permiten fácilmente la detección rápida de compuestos que pueden mejorar la comunicación neuronal. Como tal, estos métodos son valiosos no solo para el estudio de la ELA, sino para todas las áreas de la investigación neurodegenerativa y de la neurociencia del desarrollo.

Después de la implementación exitosa del protocolo anterior, se muestran resultados representativos para un experimento típico de liberación de vesículas sinápticas de colorante de estirilo. Las neuronas corticales primarias de rata cultivadas se cargaron con colorante utilizando el método descrito en la sección 6. La especificidad de la carga del colorante se determinó mediante el co-etiquetado con el marcador de vesícula sináptica sinaptofisina. La mayoría de los puntos positivos para colorante de estirilo ...

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Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Estos métodos permiten una evaluación rápida de si una manipulación experimental, una proteína causante de la enfermedad o un ARN pueden afectar los procesos sinápticos, y si los compuestos terapéuticos pueden restaurar la función. Estas técnicas proporcionan una lectura confiable de la función sináptica de un grupo de neuronas en un período de tiempo relativamente corto en comparación con la electrofisiología. Este protocolo se puede aplicar a cualquier enfermedad del desarrollo o degeneración neuronal.Esto funciona bien para cultivos neuronales primarios de roedores y para neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas. Para comenzar, optimice la configuración de adquisición de imágenes utilizando el software de adquisición de imágenes confocales. Mantenga constante el tiempo de exposición de la potencia de excitación, la ganancia del detector y la velocidad de fotogramas en todas las muestras.Para las imágenes de lapso de tiempo, seleccione una relación de aspecto de 512 por 512 y una velocidad de fotogramas de dos imágenes por segundo para minimizar el blanqueamiento del tinte. A continuación, seleccione las combinaciones de excitación por fluorescencia, dicroico y filtro de emisión para GCaMP seis M/GCaMP tres con Fitzy y tinte estearoil con Trixi. Para evitar la deriva Z durante las imágenes de lapso de tiempo, utilice la función de enfoque perfecto del software de adquisición de imágenes confocales.A continuación, seleccione la pestaña de hora en el panel de adquisición de imágenes. Para la fase uno, establezca un intervalo de 500 milisegundos y una duración de tres a cinco minutos. Y para la fase dos, establezca el intervalo de 500 milisegundos y la duración, cinco minutos.Luego, para ensamblar el aparato de perfusión por gravedad para líquido cefalorraquídeo artificial o ACSF, cargue el tampón ACSF de cloruro de potasio alto en una jeringa de 50 mililitros en la parte superior del aparato y ajuste la velocidad de flujo a un mililitro por minuto. Luego, cargue un plato de vidrio de 35 mililitros que contenga neuronas en la etapa de imagen confocal con el extremo del tubo de perfusión colocado en el borde del plato y elija el campo para la obtención de imágenes. 48 horas después de la transfección, incubar las neuronas corticales o motoras primarias en un tampón ACSF bajo en cloruro de potasio durante 10 minutos a 37 grados centígrados.Luego retire el tampón por aspiración y usando una pipeta, cargue las neuronas en la oscuridad en una placa de Petri con fondo de vidrio llena de ACSF que contiene cloruro de potasio 50 milimolares y 10 colorantes de espirilo micromolar. Después de cinco minutos, retire la solución de carga y bañe las neuronas en un tampón ACSF bajo en cloruro de potasio a 37 grados Celsius durante 10 minutos para eliminar la carga de tinte inespecífica. Luego coloque el plato en la etapa de imágenes del microscopio confocal invertido y observe las células bajo un objetivo de aire 20 veces o un objetivo de inmersión de aceite 40 veces.Excite el tinte de acero con un láser de 546 nanómetros y recoja la emisión utilizando un filtro de paso de banda de 570 a 620 nanómetros. Después de seleccionar el campo de imagen y el enfoque perfecto, tome una sola imagen fija con campo brillante, Trixi y canales marcadores de fluorescencia para marcar los límites neuronales. Luego inicie Run Now en el software de adquisición y realice el registro basal durante tres a cinco minutos para excluir las variaciones en la intensidad del tinte.Justo en el cambio a la fase dos, active el botón de encendido para el sistema de perfusión y perfunda constantemente cloruro de potasio milimolar 50 a las neuronas para facilitar la descarga del tinte. Realice las grabaciones durante cinco minutos y luego active el interruptor de apagado para el sistema de perfusión. Guarde el experimento para el análisis de datos más tarde utilizando el software confocal.48 horas después de la transfección con GCaMP seis M, incubar las neuronas corticales primarias de roedores con bajo contenido de cloruro de potasio ACSF durante 15 minutos. Luego monte el plato en la plataforma de imágenes y visualice la fluorescencia GCaMP de seis M utilizando un filtro Fitzy y un objetivo de 20 veces o 40 veces. Después de seleccionar el campo de imagen y el enfoque perfecto atractivo, tome una sola imagen fija con canales de marcadores de campo brillante, Fitzy y fluorescencia para marcar los límites neuronales.A continuación, inicie Run Now en el software de adquisición y realice la grabación basal durante tres a cinco minutos. Luego perfunda ACSF que contiene cloruro de potasio 50 milimolar a las neuronas como se demostró anteriormente y registre durante cinco minutos. Cuando se detenga la adquisición de la imagen, guarde el experimento y proceda al análisis de datos utilizando el software confocal.Para el análisis de imágenes, abra las imágenes de lapso de tiempo en el software confocal y alinee las imágenes haciendo clic en Imagen, seguido de procesamiento, seguido de alinear documento actual y, a continuación, seleccione Alinear con el primer fotograma. Seleccione las regiones de interés a lo largo de las neuritas utilizando la herramienta de selección de ROI y también marque un ROI que represente la intensidad de fluorescencia de fondo. A continuación, inicie la función de medición desde el panel de medición de tiempo para medir la fluorescencia bruta a lo largo del tiempo para los ROI seleccionados.Después de la medición, exporte las intensidades de fluorescencia en bruto al software de hoja de cálculo. Aquí se muestran las neuronas corticales primarias de rata cultivadas cargadas con colorante de estirilo. La especificidad de la carga del colorante se determinó mediante el coetiquetado con el marcador de vesícula sináptica sinaptofisina y la mayoría de los puntos positivos de colorante estéril son copositivos para este marcador.El análisis de los valores de intensidad bruta durante todo el período de imagen revela que la sinaptofisina y la intensidad permanecen constantes, mientras que la intensidad del tinte de estirilo disminuye después de la estimulación. Para las neuronas de control transfectadas por proteínas fluorescentes verdes, la liberación exitosa de vesículas sinápticas resultó en la sorprendente pérdida de fluorescencia del colorante tras una alta despolarización de cloruro de potasio. Este video representativo muestra una neurona descargando selectivamente el tinte de estirilo en una nueva región derecha después de la estimulación.En contraste, en las neuronas transfectadas con un C nueve ORF 72 vinculado a la construcción de repetición del péptido de colorante a GA 50, la transmisión sináptica deteriorada está representada por la fluorescencia del colorante retenida incluso después de una alta despolarización de cloruro de potasio. Aquí se muestran imágenes representativas de fluorescencia de neuronas corticales transfectadas con GCaMP seis M antes y después de la despolarización del cloruro de potasio. El aumento de los valores de fluorescencia y las neuronas corticales transfectadas con GCaMP seis M indican la entrada de calcio en las neuritas después de la despolarización inducida por cloruro de potasio.Al final del período de registro basal, las neuronas expresaron GCaMP seis M con una baja fluorescencia. Luego se observa un aumento dramático de la fluorescencia al comienzo de la estimulación. Asegúrese de que los registros de referencia de fluorescencia para el tinte de estirilo y GCaMP sean estables.Siempre use un enfoque perfecto para evitar la deriva de la imagen, lo que haría que el procesamiento de datos de imágenes posteriores sea un desafío. No se recomienda un mayor cultivo de neuronas, ya que los platos se exponen al aire durante la profusión. Sin embargo, la inmunomantación o la extracción de proteínas o ARN pueden evaluar las posibles causas de las alteraciones sinápticas.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Investigación

Neurociencias

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Imágenes en tiempo real de Axonal Transporte de Quantum Dot-etiquetado BDNF en las neuronas primarias

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

Un protocolo para la administración de Real-Time fMRI entrenamiento de Neurofeedback

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

En tiempo real en el seguimiento de Vitro de la activación del Receptor odorante por un olor en la fase de Vapor

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis

Programa integral de autopsias para individuos con esclerosis múltiple

We describe a rapid tissue donation program for individuals with multiple sclerosis (MS) that requires scientists and technicians to be on-call 24/7, 365 ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Indicadores de sinapsis únicas de liberación y aceptación de glutamato en rebanadas cerebrales agudas de ratones normales y Huntington

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other ...

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

Uso del inmunoensayo de electroforesis capilar para buscar biomarcadores potenciales de la esclerosis lateral amiotrófica en plaquetas humanas

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...