Name: light-induced gfp expression in zebrafish embryos using the optogenetic tael/c120 system
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System at JoVE.com

我们感谢斯特凡·马特纳和伍和马特纳实验室的成员对本协议的有益建议和评论。我们感谢安娜·里德、凯文·加德纳和劳拉·莫塔-梅纳在制定本协议时所做的宝贵讨论和见解。这项工作得到了国家卫生研究院（国家卫生研究院）的赠款的支持。R03 DK106358）和加州大学癌症研究协调委员会（CRN-20-636896）到S.W.

这项研究是经加州大学默塞德分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准进行的。
1. 斑马鱼穿越和胚胎采集
<ol><li>保持单独的转基因斑马鱼线，其中包含TAEL转录激活剂或C120控制的记者基因，以尽量减少虚假激活。</li>
	<li>使用标准方法9从每条线上穿过6-8只成年斑马鱼，产生含有TAEL和C120成分的双转基因胚胎（图1B）。 注：或者，...

<ol>
	<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish.">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).</li><li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling.">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li><li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools.">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li><li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAEL:+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control.">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), 345-355 (2017).</li><li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAEL+2.0:+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish.">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li><li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222.">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).</li><li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+DNA,+RNA,+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function.">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li><li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control.">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish.">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738 (2012).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology.">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), (2019).</li></ol>

本协议描述了使用光遗传学 TAEL/C120 系统实现蓝光诱导基因表达。该系统由转录激活器 TAEL 组成，该激活器在蓝光照射下变暗，并激活 C120 调控元素下游感兴趣的基因的转录。在光照曝光后，可以检测到 GFP 记者的诱导表达，这表明此方法具有相对快速和响应灵敏的动能。
有几个因素会影响上岗水平。最关键的是激活光的波长和功率。在此协议中，使用了 465 nm LED 灯，其速度?...

诱导基因表达系统有助于控制基因表达的数量、时间和位置。然而，在多细胞生物体中实现精确的空间和时间控制是具有挑战性的。时间控制最常通过添加小分子化合物1 或激活热冲击促进剂2来实现。尽管如此，这两种方法都容易受到时间、上岗强度和偏离目标压力反应等问题的影响。空间控制主要通过使用组织特异性促进剂3来实现，但这种方法需要一个合适的促进者或调节元素，这些元素并不总是可用的，也不利于亚组织水平的诱导。
与这种传统方法相比，光激活光遗传学转录活化器具有更精细的基因表达空间和时间控制的潜力。蓝光响应TAEL/C120系统被开发和优化，用于斑马鱼胚胎5，6。该系统基于来自E.利托拉利斯7，8细菌的内源光活化转录因子。TAEL/C120 系统由称为 TAEL 的转录激活器组成，该激活器包含 Kal-TA4 转激活域、蓝光响应 LOV（光氧电压感应）域和六角形转氦 （HTH） DNA 绑定域5。照明后，LOV域经历了构象变化，允许两个TAEL分子变暗，与TAEL响应C120促进器结合，并启动下游感兴趣的基因5，8的转录。TAEL/C120 系统具有快速和坚固的感应，毒性最小，并且可以通过多种不同的送光方式激活。最近，通过向 TAEL （TAEL-N） 添加核定位信号，并将 C120 监管元素与 cFos 玄武岩促进器 （C120F） （图 1A）耦合，对 TAEL/C120 系统进行了改进。这些修改使感应水平提高了15倍以上6倍。
在此协议中，一个简单的 LED 面板用于激活 TAEL/C120 系统并诱导记者基因 GFP 的无处不在的表达。可以通过观察荧光强度或使用定量实时 PCR （qRT-PCR） 测量成绩单水平来定性地监测表达感应。该协议将证明TAEL/C120系统是一个多功能，易于使用的工具，使强大的调节基因表达 在体内。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioRender web-based science illustration tool</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>https://biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CCD digital camera</td>
			<td>Lumenara</td>
			<td>755-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4&#34; LCD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter, 545 nm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ET545/25x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra RNAspin Mini kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>95017-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instsant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B017GWDF7E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEARPOW Programmable digital timer switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01G6O28NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fast mix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>101414-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop image procesing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT cDNA SuperMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>10142-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120 Fluorescence LED light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>010-00326R</td>
			<td>Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced gfp expression in zebrafish embryos using the optogenetic tael/c120 system

诱导基因表达系统是研究生物过程的宝贵工具。光遗传表达系统可以利用光作为诱导剂，精确控制基因表达的时间、位置和振幅。在这个协议中，光遗传表达系统用于在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。该系统依赖于一个工程转录因子称为TAEL基于自然发生的光激活转录因子从细菌 E.利托拉利斯。当蓝光照射时，TAEL 变暗，与称为 C120 的认知调节元素结合，并激活转录。该协议使用转基因斑马鱼胚胎，表达TAEL转录因子在无处不在的 无所 不在的促进者控制下。同时，C120 调控元素驱动荧光记者基因 （GFP） 的表达。使用简单的 LED 面板提供激活蓝光，GFP 表达感应可在 30 分钟的照明后首先检测到，并在 3 小时光处理后达到 130 倍以上感应的峰值。表达感应可以通过定量实时PCR（qRT-PCR）和荧光显微镜进行评估。这种方法是一种多功能且易于使用的光遗传基因表达方法。

对于这次演示，一条C120响应的GFP记者线（Tg（C120F：GFP）ucm107）与一条转基因线交叉，该线表示TAEL-N无处不在，来自无处不在的b（ubb：TAEL-N）促进器（Tg（ubb：TAEL-N）ucm113），以产生含有这两种元素的双转基因胚胎。24小时受精后，胚胎暴露在激活蓝光下，脉冲频率为1h/1h关闭。激活后 30 分钟、1 小时、3 小时和 6 小时（图 2B和<strong...

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Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

光遗传学是一种功能强大的工具，具有广泛的应用。该协议演示了如何使用蓝光响应 TAEL/C120 系统在斑马鱼胚胎中实现光诱导基因表达。

使用光遗传TAEL/C120系统在斑马鱼胚胎中的光诱导GFP表达

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

此协议意义重大，因为它是一种光遗传学或光激活方法，用于在完整的生物体中诱导基因表达。在我们的例子中，斑马鱼胚胎。这种技术的优点是，它使用光，作为诱导剂，这允许非常精确，空间和时间控制感应。此协议对于任何诱导基因表达有用的情况都很有用。这包括血统追踪、功能获取分析或救援实验等。首先，LED 面板相对于含有胚胎的 Petri 盘，可以同时向多个胚胎提供每平方厘米 1.5 毫瓦的光功率。为了降低照片损坏尾部转录激活器的风险，如果照明超过三小时，则使用定时器继电器每隔一小时发布一小时。取出培养皿盖，以尽量减少凝结产生的光散射。放置含有控制胚胎的培养皿和用于深色控制的防光盒。在所需的激活持续时间后，从照明中取出胚胎。对于完全 RNA 提取，请使用 RNA 提取套件。将胚胎转移到1.5毫升的微型离心机管中，并去除多余的卵水。添加裂解缓冲后，将胚胎与塑料害虫同质化。将解酯转移到提供的试剂盒中，并按照制造商的指示净化RNA。将纯RNA储存在零下20至零下80摄氏度，直到使用或立即合成CDNA从一微克，总RNA使用cDNA合成套件，按照制造商的指示。将一微克RNA加入薄壁0.2毫升，PCR管，含有4微升，5倍cDNA反应主混合物，然后加入1微升，20倍反向转录酶溶液。接下来，用无核酸酶水组成20微升的最终体积。将管子放入编程的热循环器中，以便 cDNA 合成。将合成的 cDNA 存储在零下 20 摄氏度，直到使用或立即用于定量评估。设置包含网络绿色酶主混合物的定量 PCR 反应。五倍稀释cDNA和GFP引物在325纳米摩尔浓度的三叶虫和进行反应在编程的实时PCR机。反应完成后，分析熔化曲线以确定反应特异性。使用双三角洲 CT 方法计算光激活感应，作为相对于对照胚胎的折叠变化。并使用统计软件来确定其重要性。从照明中取出胚胎后，将胚胎固定在3%甲基纤维素中成像，其中含有0.01%的三甲基苯在玻璃抑郁症幻灯片中。使用标准 GFP 滤镜设置，在连接到数码相机的荧光立体显微镜上获取荧光和亮场图像。收购后，将亮场和荧光图像与图像处理软件合并。GFP 表达的量化表示在蓝光照射后 30 分钟就感应了表情。然后，GFP 表达水平继续增加，长达 6 小时，激活后稳步上升。GFP 诱导还通过在激活后的同一时间点检查荧光强度进行定性评估。GFP 荧光高于背景水平首先在激活后三小时观察到，并在激活后六小时明显变亮。相比之下，控制胚胎的所有时间点，保持在黑暗中，没有表现出任何明显的GFP荧光。激活光必须在可见光谱的蓝色范围内。房间的光线和阳光都包含一些蓝光。因此，请注意保护您的负控制免受任何环境光源的照射。TAEL C120 系统采用基因编码和模块化，可驱动任何感兴趣的基因表达。因此，结合其他技术，它可以用来回答一系列生物问题。

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