Name: light-induced gfp expression in zebrafish embryos using the optogenetic tael/c120 system
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System at JoVE.com

Nous remercions Stefan Materna et les membres des laboratoires Woo et Materna pour leurs suggestions et commentaires utiles sur ce protocole. Nous remercions Anna Reade, Kevin Gardner et Laura Motta-Mena pour leurs précieuses discussions et idées lors de l’élaboration de ce protocole. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) et le Comité de coordination de la recherche sur le cancer de l’Université de Californie (CRN-20-636896) à S.W.

Cette étude a été réalisée avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie Merced.
1. Croisement de poissons-zèbres et collecte d’embryons
<ol><li>Maintenir des lignées de poissons-zèbres transgéniques distinctes contenant soit l’activateur transcriptionnel TAEL, soit le gène rapporteur contrôlé par C120 afin de minimiser l’activation fallacieuse.</li>
	<li>Croisez 6 à 8 poissons-zèbres adultes de<sup class=...

<ol>
	<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish.">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).</li><li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling.">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li><li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools.">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li><li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAEL:+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control.">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), 345-355 (2017).</li><li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAEL+2.0:+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish.">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li><li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222.">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).</li><li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+DNA,+RNA,+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function.">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li><li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control.">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish.">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738 (2012).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology.">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), (2019).</li></ol>

Ce protocole décrit l’utilisation du système optogénétique TAEL/C120 pour obtenir une expression génique inductible à la lumière bleue. Ce système est constitué d’un activateur transcriptionnel, TAEL, qui dimérise lors de l’éclairage avec de la lumière bleue et active la transcription d’un gène d’intérêt en aval d’un élément régulateur C120. L’expression induite d’un rapporteur GFP peut être détectée après aussi peu que 30 minutes d’exposition à la lumière, ce qui suggère que ce...

Les systèmes d’expression génique inductibles aident à contrôler la quantité, le moment et l’emplacement de l’expression des gènes. Cependant, il a été difficile d’obtenir un contrôle spatial et temporel exact dans les organismes multicellulaires. Le contrôle temporel est le plus souvent obtenu par l’ajout de composés à petites molécules1 ou l’activation de promoteurs de choc thermique2. Pourtant, les deux approches sont vulnérables aux problèmes de timing, de force d’induction et de réponses au stress hors cible. Le contrôle spatial est principalement réalisé par l’utilisation de promoteurs spécifiques aux tissus 3 , maiscetteapproche nécessite un promoteur ou un élément régulateur approprié, qui ne sont pas toujours disponibles, et elle n’est pas propice à l’induction au niveau des sous-tissus.
Contrairement à ces approches conventionnelles, les activateurs transcriptionnels optogénétiques activés par la lumière ont le potentiel d’un contrôle spatial et temporel plus fin de l’expression des gènes4. Le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue a été développé et optimisé pour une utilisation dans les embryons de poisson zèbre5,6. Ce système est basé sur un facteur de transcription endogène activé par la lumière de la bactérie E. litoralis7,8. Le système TAEL/C120 se compose d’un activateur transcriptionnel appelé TAEL qui contient un domaine de transactivation Kal-TA4, un domaine LOV (détection lumière-oxygène-tension) sensible à la lumière bleue et un domaine de liaison à l’ADN HTH (helix-turn-helix)5. Lorsqu’ils sont éclairés, les domaines LOV subissent un changement conformationnel qui permet à deux molécules TAEL de se dimériser, de se lier à un promoteur C120 sensible au TAEL et d’initier la transcription d’un gène d’intérêt en aval5,8. Le système TAEL/C120 présente une induction rapide et robuste avec une toxicité minimale, et il peut être activé par plusieurs modalités de livraison de lumière différentes. Récemment, des améliorations ont été apportées au système TAEL/C120 en ajoutant un signal de localisation nucléaire au TAEL (TAEL-N) et en couplant l’élément régulateur C120 à un promoteur basal cFos (C120F)(Figure 1A). Ces modifications ont amélioré les niveaux d’induction de plus de 15 fois6.
Dans ce protocole, un simple panneau LED est utilisé pour activer le système TAEL/C120 et induire l’expression omniprésente d’un gène rapporteur, GFP. L’induction de l’expression peut être surveillée qualitativement en observant l’intensité de fluorescence ou quantitativement en mesurant les niveaux de transcription à l’aide de la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Ce protocole démontrera le système TAEL/C120 comme un outil polyvalent et facile à utiliser qui permet une régulation robuste de l’expression des gènes in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioRender web-based science illustration tool</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>https://biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CCD digital camera</td>
			<td>Lumenara</td>
			<td>755-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4&#34; LCD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter, 545 nm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ET545/25x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra RNAspin Mini kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>95017-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instsant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B017GWDF7E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEARPOW Programmable digital timer switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01G6O28NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fast mix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>101414-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop image procesing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT cDNA SuperMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>10142-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120 Fluorescence LED light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>010-00326R</td>
			<td>Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced gfp expression in zebrafish embryos using the optogenetic tael/c120 system

Les systèmes d’expression génique inductibles sont un outil inestimable pour l’étude des processus biologiques. Les systèmes d’expression optogénétique peuvent fournir un contrôle précis sur le moment, l’emplacement et l’amplitude de l’expression des gènes en utilisant la lumière comme agent inducteur. Dans ce protocole, un système d’expression optogénétique est utilisé pour obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre. Ce système repose sur un facteur de transcription conçu appelé TAEL basé sur un facteur de transcription naturel activé par la lumière de la bactérie E. litoralis. Lorsqu’il est éclairé par une lumière bleue, TAEL se dimérise, se lie à son élément régulateur apparenté appelé C120 et active la transcription. Ce protocole utilise des embryons transgéniques de poisson zèbre qui expriment le facteur de transcription TAEL sous le contrôle du promoteur ubb omniprésent. Dans le même temps, l’élément régulateur C120 entraîne l’expression d’un gène rapporteur fluorescent (GFP). En utilisant un simple panneau LED pour délivrer une lumière bleue activatrice, l’induction de l’expression GFP peut d’abord être détectée après 30 minutes d’éclairage et atteint un pic de plus de 130 fois l’induction après 3 h de traitement par la lumière. L’induction de l’expression peut être évaluée par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et par microscopie à fluorescence. Cette méthode est une approche polyvalente et facile à utiliser pour l’expression des gènes optogénétiques.

Pour cette démonstration, une ligne rapporteur GFP sensible au C120 (Tg(C120F:GFP)ucm107)) a été croisée avec une ligne transgénique qui exprime TAEL-N de manière omniprésente à partir du promoteur de l’ubiquitine b (ubb) (Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) pour produire des embryons transgéniques doubles contenant les deux éléments. 24 h après la fécondation, les embryons ont été exposés à l’activation de la lumière bleue, pulsée à une fréquence de 1...

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Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

L’optogénétique est un outil puissant avec de nombreuses applications. Ce protocole montre comment obtenir une expression génique inductible à la lumière chez les embryons de poisson-zèbre en utilisant le système TAEL/C120 sensible à la lumière bleue.

Expression de GFP induite par la lumière dans des embryons de poisson-zèbre à l’aide du système optogénétique TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

Ce protocole est important car il s’agit d’une méthode optogénétique, ou activée par la lumière, pour induire l’expression des gènes, dans un organisme intact. Dans notre cas, un embryon de poisson zèbre. L’avantage de cette technique, c’est qu’elle utilise la lumière, comme agent inducteur, ce qui permet un contrôle très précis, spatial et temporel de l’induction.Ce protocole serait utile pour toute situation où l’expression génique inductible serait utile. Cela inclut des choses comme le traçage de la lignée, les tests de gain de fonction ou les expériences de sauvetage. Pour commencer, positionnez le panneau LED par rapport aux boîtes de Petri contenant des embryons pour délivrer 1,5 milliwatts par centimètre carré de puissance de lumière à plusieurs embryons à la fois.Pour réduire le risque d’endommagement photo de l’activateur transcriptionnel de la queue, affichez la lumière à des intervalles d’une heure à l’aide d’un relais de minuterie, si elle s’allume pendant plus de trois heures. Retirez les couvercles des boîtes de Petri pour minimiser la diffusion de la lumière due à la condensation. Placez des boîtes de Petri contenant des embryons témoins et une boîte à l’épreuve de la lumière pour les témoins sombres.Retirez les embryons de l’éclairage, après la durée d’activation souhaitée. Pour l’extraction totale de l’ARN, utilisez un kit d’extraction d’ARN. Transférer les embryons dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et éliminer l’excès d’eau d’œuf.Après avoir ajouté un tampon de lyse, homogénéiser les embryons avec le pilon en plastique. Transférez le lysate dans une colonne fournie par le kit et suivez les instructions du fabricant pour purifier l’ARN. Conservez l’ARN purifié, à moins 20 à moins 80 degrés Celsius, jusqu’à l’utilisation ou synthétisez immédiatement l’ADNc à partir d’un microgramme, l’ARN total à l’aide du kit de synthèse de l’ADNc, en suivant les instructions du fabricant.Ajouter un microgramme d’ARN dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 millilitre, contenant quatre microlitres, de cinq fois le mélange maître de la réaction d’ADNc, suivi de l’ajout d’un microlitre, de 20 fois la solution enzymatique de transcriptase inverse. Ensuite, composez un volume final de 20 microlitres, avec de l’eau sans nucléase. Placez le tube dans un thermocycleur programmé pour la synthèse de l’ADNc.Conserver l’ADNc synthétisé à moins 20 degrés Celsius jusqu’à utilisation ou utilisation immédiate pour l’évaluation quantitative. Mettre en place les réactions PCR quantitatives contenant le mélange maître d’enzymes cyber-vertes. Cinq fois dilués d’ADNc et de GFP à une concentration de 325 nanomolaires dans des triplicates et conduisent la réaction dans une machine pcR programmée en temps réel.À la fin de la réaction, analysez la courbe de fusion pour déterminer la spécificité de la réaction. Calculez l’induction activée par la lumière lorsque le pli change par rapport aux embryons témoins à l’aide de la méthode de double TD Delta. Et utilisez un logiciel statistique pour déterminer la signification.Après avoir retiré les embryons de l’éclairage, immobiliser les embryons pour l’imagerie dans 3% de méthylcellulose contenant 0,01% de tricaïne dans des lames de dépression en verre. Obtenez des images de fluorescence et de champ lumineux sur un stéréomicroscope fluorescent connecté à un appareil photo numérique à l’aide des paramètres de filtre GFP standard. Fusionnez les images en champ clair et en fluorescence après l’acquisition avec un logiciel de traitement d’image.La quantification de l’expression de la GFP a indiqué l’induction de l’expression dès 30 minutes après l’exposition à la lumière bleue. Les niveaux d’expression de GFP ont ensuite continué à augmenter jusqu’à six heures, après l’activation régulièrement. L’induction de GFP a également été évaluée qualitativement en examinant l’intensité de fluorescence aux mêmes points de temps après l’activation.La fluorescence GFP au-dessus des niveaux de fond a été observée pour la première fois trois heures après l’activation et est devenue nettement plus brillante six heures après l’activation. En revanche, les embryons de contrôle pour tous les points temporels, maintenus dans l’obscurité, ne présentaient pas de fluorescence GFP appréciable. La lumière d’activation doit être dans la gamme bleue du spectre de la lumière visible.La lumière de la pièce et la lumière du soleil contiennent de la lumière bleue. Prenez donc soin de protéger vos contrôles négatifs de toute source de lumière ambiante. Le système TAEL C120 est génétiquement codé et modulaire et peut conduire l’expression de n’importe quel gène d’intérêt.Ainsi, combiné avec d’autres techniques, il peut être utilisé pour répondre à une gamme de questions biologiques.

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