Name: light-induced gfp expression in zebrafish embryos using the optogenetic tael/c120 system
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System at JoVE.com

हम इस प्रोटोकॉल पर उपयोगी सुझावों और टिप्पणियों के लिए स्टीफन मैटरा और वू और मैटरनिटी लैब्स के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम इस प्रोटोकॉल को विकसित करते समय मूल्यवान चर्चा और अंतर्दृष्टि के लिए अन्ना रीडे, केविन गार्डनर और लौरा मोट्टा-मेना को धन्यवाद देते हैं। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के अनुदानों द्वारा समर्थित किया गया था; R03 DK106358) और कैलिफोर्निया कैंसर अनुसंधान समन्वय समिति (CRN-20-636896) एसडब्ल्यू के लिए विश्वविद्यालय

यह अध्ययन कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय मर्सीड की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुमोदन से किया गया था।
1. ज़ेब्राफ़िश क्रॉसिंग और भ्रूण संग्रह
<ol><li>नकली सक्रियण को कम करने के लिए टी...

<ol>
	<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish.">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).</li><li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling.">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li><li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools.">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li><li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAEL:+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control.">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), 345-355 (2017).</li><li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAEL+2.0:+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish.">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li><li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222.">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li><li>Motta-Mena, L. 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(69), e4196 (2012).</li><li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+DNA,+RNA,+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function.">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li><li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control.">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish.">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738 (2012).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology.">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), (2019).</li></ol>

यह प्रोटोकॉल नीली रोशनी-अक्षम जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक TAEL/C120 प्रणाली के उपयोग का वर्णन करता है । इस प्रणाली में एक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर, TAEL होता है, जो नीली रोशनी के साथ रोशन?...

अकांक्षित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली जीन अभिव्यक्ति की मात्रा, समय और स्थान को नियंत्रित करने में मदद करती है। हालांकि, बहुकोशिकीय जीवों में सटीक स्थानिक और लौकिक नियंत्रण प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण रहा है। टेम्पोरल कंट्रोल सबसे अधिक छोटे अणु यौगिकों 1 या हीट शॉक प्रमोटरों की सक्रियता2 जोड़कर हासिल कियाजाताहै। फिर भी, दोनों दृष्टिकोण समय, प्रेरण शक्ति, और ऑफ-टारगेट तनाव प्रतिक्रियाओं के मुद्दों के प्रति असुरक्षित हैं । स्थानिक नियंत्रण मुख्य रूप से ऊतक-विशिष्ट प्रमोटरों 3 के उपयोग से प्राप्तहोताहै, लेकिन इस दृष्टिकोण के लिए एक उपयुक्त प्रमोटर या नियामक तत्व की आवश्यकता होती है, जो हमेशा उपलब्ध नहीं होते हैं, और यह उप-ऊतक स्तर प्रेरण के लिए अनुकूल नहीं है।
इस तरह के पारंपरिक दृष्टिकोणों के विपरीत, हल्के सक्रिय ऑप्टोजेनेटिक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर में जीन अभिव्यक्ति4के महीन स्थानिक और लौकिक नियंत्रण की क्षमता होती है। नीली रोशनी-उत्तरदायी TAEL/C120 प्रणाली को जेब्राफिश भ्रूण5,6में उपयोग के लिए विकसित और अनुकूलित किया गया था। यह प्रणाली जीवाणु ई. लिटोरलिस7, 8से एक अंतर्जात प्रकाश-सक्रिय प्रतिलेखन कारक पर आधारित है। TAEL/C120 सिस्टम में एक ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर होता है जिसे TAEL कहा जाता है जिसमें काल-TA4 ट्रांसएक्टिवेशन डोमेन, नीली बत्ती-उत्तरदायी लव (लाइट-ऑक्सीजन-वोल्टेज सेंसिंग) डोमेन, और एक हेलिक्स-टर्न-हेलिक्स (एचटीएच) डीएनए-बाध्यकारी डोमेन5शामिल है । जब प्रबुद्ध होते हैं, तो LOV डोमेन एक अनुरूप परिवर्तन से गुजरते हैं जो दो TAEL अणुओं को मंद करने, एक TAEL-उत्तरदायी C120 प्रमोटर से बांधने और ब्याज5, 8के डाउनस्ट्रीम जीन के प्रतिलेखन की शुरुआत करने की अनुमतिदेताहै। TAEL/C120 प्रणाली न्यूनतम विषाक्तता के साथ तेजी से और मजबूत प्रेरण प्रदर्शित करती है, और इसे कई अलग-अलग प्रकाश वितरण तौर-तरीकों से सक्रिय किया जा सकता है। हाल ही में, TAEL/C120 प्रणाली में सुधार TAEL (TAEL-N) के लिए एक परमाणु स्थानीयकरण संकेत जोड़कर और एक cFos बेसल प्रमोटर (C120F)(चित्रा 1A)के लिए C120 नियामक तत्व युग्मन द्वारा किए गए थे । इन संशोधनों से 15 गुना6से अधिक प्रेरण स्तर में सुधार हुआ ।
इस प्रोटोकॉल में, एक साधारण एलईडी पैनल का उपयोग TAEL/C120 प्रणाली को सक्रिय करने और एक रिपोर्टर जीन, जीएफपी की सर्वव्यापी अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए किया जाता है । मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्ट स्तरों को मापकर फ्लोरेसेंस तीव्रता या मात्रात्मक रूप से देख कर अभिव्यक्ति प्रेरण की गुणात्मक निगरानी की जा सकती है। यह प्रोटोकॉल एक बहुमुखी, आसानी से उपयोग करने वाले उपकरण के रूप में TAEL/C120 प्रणाली का प्रदर्शन करेगा जो वीवो मेंजीन अभिव्यक्ति के मजबूत नियमन को सक्षम बनाता है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioRender web-based science illustration tool</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>https://biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CCD digital camera</td>
			<td>Lumenara</td>
			<td>755-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4&#34; LCD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter, 545 nm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ET545/25x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra RNAspin Mini kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>95017-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instsant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B017GWDF7E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEARPOW Programmable digital timer switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01G6O28NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fast mix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>101414-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop image procesing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT cDNA SuperMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>10142-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120 Fluorescence LED light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>010-00326R</td>
			<td>Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced gfp expression in zebrafish embryos using the optogenetic tael/c120 system

अकांक्षित जीन अभिव्यक्ति प्रणाली जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अमूल्य उपकरण हैं। ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति सिस्टम उत्प्रेरण एजेंट के रूप में प्रकाश का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति समय, स्थान और आयाम पर सटीक नियंत्रण प्रदान कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश-अक्षम जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग किया जाता है। यह प्रणाली जीवाणु ई. लिटोरालिससे स्वाभाविक रूप से होने वाले प्रकाश-सक्रिय प्रतिलेखन कारक के आधार पर TAEL नामक एक इंजीनियर ट्रांसक्रिप्शन कारक पर निर्भर करती है। जब नीली रोशनी से प्रकाशित होता है, तो TAEL dimerizes, C120 नामक अपने कॉग्नेट नियामक तत्व को बांधता है, और प्रतिलेखन को सक्रिय करता है। यह प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग करता है जो सर्वव्यापी यूबीबी प्रमोटर के नियंत्रण में TAEL प्रतिलेखन कारक को व्यक्त करता है। इसके साथ ही सी120 रेगुलेटरी एलिमेंट फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन (जीएफपी) की अभिव्यक्ति को ड्राइव करता है । सक्रिय नीली रोशनी देने के लिए एक साधारण एलईडी पैनल का उपयोग करना, GFP अभिव्यक्ति के प्रेरण को पहले 30 मिनट की रोशनी के बाद पता लगाया जा सकता है और प्रकाश उपचार के 3 घंटे के बाद 130 गुना से अधिक प्रेरण के शिखर तक पहुंचता है। अभिव्यक्ति प्रेरण का मूल्यांकन मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है। यह विधि ऑप्टोजेटिक जीन अभिव्यक्ति के लिए एक बहुमुखी और उपयोग में आसान दृष्टिकोण है।

इस प्रदर्शन के लिए, एक C120-उत्तरदायी GFP रिपोर्टर लाइन(Tg (C120F: GFP)ucm107))एक ट्रांसजेनिक लाइन है कि सर्वव्यापक बी (ubb)प्रमोटर(Tg (ubb: TABB: TAEL-N)ucm113)से टीएईएल-एन सर्वव्यापी व्यक्त के साथ पार किया गया था दोन?...

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Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

ऑप्टोजेनेटिक्स व्यापक अनुप्रयोगों के साथ एक शक्तिशाली उपकरण है। यह प्रोटोकॉल नीले प्रकाश-उत्तरदायी TAEL/C120 प्रणाली का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश-अक्षुशील जीन अभिव्यक्ति को कैसे प्राप्त करना दर्शाता है ।

ऑप्टोजेनेटिक TAEL/C120 सिस्टम का उपयोग कर जेब्राफिश भ्रूण में प्रकाश प्रेरित GFP अभिव्यक्ति

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एक अक्षुण्ण जीव में जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए एक ऑप्टोजेनेटिक, या प्रकाश-सक्रिय विधि है। हमारे मामले में, एक जेब्राफिश भ्रूण। इस तकनीक का लाभ यह है कि यह एक उत्प्रेरण एजेंट के रूप में प्रकाश का उपयोग करता है, जो प्रेरण के बहुत सटीक, रिक्तिद्वंद्व और लौकिक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है।यह प्रोटोकॉल किसी भी स्थिति के लिए उपयोगी होगा जहां अकांक्षित जीन अभिव्यक्ति उपयोगी होगी । इसमें वंश ट्रेसिंग, गेन-ऑफ-फंक्शन परख या बचाव प्रयोग जैसी चीजें शामिल हैं। एक बार में कई भ्रूण के लिए प्रकाश की प्रति वर्ग सेंटीमीटर शक्ति १.५ मिलीवाट देने के लिए भ्रूण युक्त पेट्री व्यंजन के सापेक्ष एलईडी पैनल की स्थिति के साथ शुरू करने के लिए ।टेल ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर को फोटो क्षति के जोखिम को कम करने के लिए, टाइमर रिले का उपयोग करके एक घंटे के अंतराल पर प्रकाश पोस्ट करें, यदि तीन घंटे से अधिक रोशन हो। संघनन से प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए पेट्री डिश लिड निकालें। नियंत्रण भ्रूण और अंधेरे नियंत्रण के लिए एक प्रकाश प्रूफ बॉक्स युक्त पेट्री व्यंजन रखें।वांछित सक्रियण अवधि के बाद, रोशनी से भ्रूण निकालें। कुल आरएनए निष्कर्षण के लिए, आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करें। भ्रूण को 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें और अंडे के अतिरिक्त पानी को हटा दें।लाइसिस बफर जोड़ने के बाद, प्लास्टिक मूसल के साथ भ्रूण को समरूप करें। lysate को एक किट प्रदान किए गए कॉलम में स्थानांतरित करें और आरएनए को शुद्ध करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। शुद्ध आरएनए को शून्य से 20 से माइनस 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, जब तक कि निर्माता के निर्देश का पालन करके सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग करके एक माइक्रोग्राम से सीडीएनए का उपयोग या तुरंत संश्लेषण न करें।एक पतली दीवार 0.2 मिलीलीटर, पीसीआर ट्यूब में आरएनए का एक माइक्रोग्राम जोड़ें, जिसमें चार माइक्रोलीटर होते हैं, पांच बार सीडीएनए रिएक्शन मास्टर मिक्स, इसके बाद एक माइक्रोलीटर के अलावा, 20 गुना रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस एंजाइम समाधान। इसके बाद नाभिक मुक्त पानी के साथ 20 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा बनाएं। सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक प्रोग्राम थर्मो साइकिलर में ट्यूब रखें।मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए उपयोग या तुरंत उपयोग होने तक संश्लेषित सीडीएनए को शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। साइबर ग्रीन एंजाइम मास्टर मिक्स युक्त मात्रात्मक पीसीआर प्रतिक्रियाओं को स्थापित करें। ट्रिपलिट्स में 325 नैनोमोलर एकाग्रता पर पांच गुना पतला सीडीएनए और जीएफपी प्राइमर और प्रोग्राम किए गए वास्तविक समय पीसीआर मशीन में प्रतिक्रिया का संचालन करते हैं।प्रतिक्रिया के पूरा होने पर, प्रतिक्रिया विशिष्टता निर्धारित करने के लिए पिघल वक्र का विश्लेषण करें। डबल डेल्टा सीटी विधि का उपयोग कर नियंत्रण भ्रूण के सापेक्ष गुना परिवर्तन के रूप में प्रकाश सक्रिय प्रेरण की गणना करें। और महत्व निर्धारित करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।रोशनी से भ्रूण को हटाने के बाद, कांच अवसाद स्लाइड में 0.01% ट्राइकेन युक्त 3% मिथाइलसेलुलोस में इमेजिंग के लिए भ्रूण को स्थिर करें। मानक जीएफपी फ़िल्टर सेटिंग्स का उपयोग करके डिजिटल कैमरे से जुड़े फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप पर फ्लोरेसेंस और ब्राइटफील्ड छवियों को प्राप्त करें। इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहण के बाद ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस इमेज को मर्ज करें।जीएफपी अभिव्यक्ति के क्वांटिफिकेशन ने नीली रोशनी के एक्सपोजर के 30 मिनट बाद ही अभिव्यक्ति को शामिल करने का संकेत दिया । GFP अभिव्यक्ति के स्तर तो छह घंटे तक वृद्धि जारी रखा, के बाद सक्रियण तेजी से । सक्रियण के बाद एक ही समय में फ्लोरेसेंस तीव्रता की जांच करके जीएफपी प्रेरण का भी गुणात्मक मूल्यांकन किया गया ।पृष्ठभूमि के स्तर से ऊपर GFP फ्लोरेसेंस पहले तीन घंटे के बाद सक्रियण पर मनाया गया था और छह घंटे के बाद सक्रियण पर काफ़ी उज्जवल बन गया । इसके विपरीत सभी समय अंक के लिए नियंत्रण भ्रूण, अंधेरे में रखा, प्रदर्शन नहीं किया, किसी भी प्रशंसनीय GFP फ्लोरेसेंस । सक्रिय प्रकाश दृश्यमान प्रकाश स्पेक्ट्रम की नीली रेंज में होना चाहिए।रूम लाइट और सूरज की रोशनी दोनों में कुछ नीली रोशनी होती है। इसलिए किसी भी परिवेश प्रकाश स्रोतों से अपने नकारात्मक नियंत्रण की रक्षा करने के लिए ध्यान रखें। TAEL C120 प्रणाली, आनुवंशिक रूप से इनकोडेड और मॉड्यूलर है और ब्याज के किसी भी जीन की अभिव्यक्ति ड्राइव कर सकते हैं ।इसलिए, अन्य तकनीकों के साथ संयुक्त, इसका उपयोग जैविक प्रश्नों की एक श्रृंखला का जवाब देने के लिए किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

लार्वा zebrafish त्वचा में एक inducible Gal4 / यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करते हुए सहज प्रतिरक्षा और Preneoplastic सेल बातचीत का लाइव इमेजिंग

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Photoconversion के बाद प्रतिदीप्ति क्षय का प्रयोग लिविंग zebrafish भ्रूण में प्रोटीन स्थिरता मापने (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

एक सह-संस्कृति प्रणाली में neuronal कनेक्शन के गठन का आकलन करने के लिए एक optogenetic दृष्टिकोण

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

एक का उपयोग कर कार्यात्मक क्लोनिंग<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte अभिव्यक्ति प्रणाली

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

GFP ट्रांसजेनिक Zebrafish Photoconvertible PSmOrange प्रणाली का प्रयोग में कोशिकाओं की ट्रैकिंग

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

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मल्टी लक्ष्य वर्णजनीय साबुत माउंट<em&gt; बगल में</em&gt; संकरण में जीन एक्सप्रेशन डोमेन की तुलना के लिए<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; भ्रूण

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

जीवित जेबराफिश भ्रूण में बायोसेंसिंग मोटर न्यूरॉन झिल्ली संभावित

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In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

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Chimeric zebrafish भ्रूण में अलग-अलग रेटिना प्रोजेनिटर्स में ट्रांसजेनिक जीन एक्सप्रेशन के vivo इमेजिंग में सेल Nonautonomous प्रभावों का अध्ययन करने के लिए

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

एवियन भ्रूण में कई प्रोटीन की तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति MRNA इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल के स्तर का परिमाणीकरण

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...