Name: light-induced gfp expression in zebrafish embryos using the optogenetic tael/c120 system
Uploaded: 2021-08-19T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System at JoVE.com

Ringraziamo Stefan Materna e i membri dei laboratori Woo e Materna per utili suggerimenti e commenti su questo protocollo. Ringraziamo Anna Reade, Kevin Gardner e Laura Motta-Mena per preziose discussioni e approfondimenti durante lo sviluppo di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH; R03 DK106358) e il Comitato di coordinamento della ricerca sul cancro dell'Università della California (CRN-20-636896) a S.W.

Questo studio è stato condotto con l'approvazione dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della California Merced.
1. Incrocio di zebrafish e raccolta di embrioni
<ol><li>Mantenere separate le linee transgeniche di zebrafish contenenti l'attivatore trascrizionale TAEL o il gene reporter controllato da C120 per ridurre al minimo l'attivazione spuria.</li>
	<li>Incrociare 6-8 pesci zebra adulti da ogni linea utilizzando i metodi standard9</s...

<ol>
	<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish.">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li><li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish.">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).</li><li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling.">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li><li>Tischer, D., Weiner, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell+signalling+with+optogenetic+tools.">Illuminating cell signalling with optogenetic tools.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).</li><li>Reade, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAEL:+a+zebrafish-optimized+optogenetic+gene+expression+system+with+fine+spatial+and+temporal+control.">TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control.</a> Development. 144 (2), 345-355 (2017).</li><li>LaBelle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAEL+2.0:+An+improved+optogenetic+expression+system+for+zebrafish.">TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish.</a> Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).</li><li>Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+natural+and+artificial+DNA+substrates+for+light-activated+LOV-HTH+transcription+factor+EL222.">Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222.</a> Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+(Danio+rerio)+laboratory:+an+introduction.">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).</li><li>Holder, N., Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+DNA,+RNA,+and+Protein+into+the+Fertilized+Zebrafish+Egg+for+Analysis+of+Gene+Function.">Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function.</a> Molecular Embryology. , 487-490 (1999).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li><li>Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+cell+ablation+in+zebrafish+using+optogenetic+transcriptional+control.">Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control.</a> Development. 147 (12), (2020).</li><li>Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+control+of+transcription+in+zebrafish.">Optogenetic control of transcription in zebrafish.</a> PloS One. 7 (11), 50738 (2012).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>Krueger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+applications+of+optogenetics+in+developmental+biology.">Principles and applications of optogenetics in developmental biology.</a> Development. 146 (20), (2019).</li></ol>

Questo protocollo descrive l'uso del sistema optogenetico TAEL/C120 per ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce blu. Questo sistema è costituito da un attivatore trascrizionale, TAEL, che dimerizza all'illuminazione con luce blu e attiva la trascrizione di un gene di interesse a valle di un elemento regolatore C120. L'espressione indotta di un reporter GFP può essere rilevata dopo appena 30 minuti di esposizione alla luce, suggerendo che questo approccio possiede una cinetica relativamente veloce e reattiva...

I sistemi di espressione genica inducibili aiutano a controllare la quantità, i tempi e la posizione dell'espressione genica. Tuttavia, ottenere l'esatto controllo spaziale e temporale negli organismi multicellulari è stato difficile. Il controllo temporale è più comunemente ottenuto aggiungendo composti a piccole molecole1 o attivazione di promotori di shock termici2. Tuttavia, entrambi gli approcci sono vulnerabili a problemi di tempistica, forza di induzione e risposte allo stress fuori bersaglio. Il controllo spaziale si ottiene principalmente con l'uso di promotori tessuto-specifici3, ma questo approccio richiede un promotore o un elemento normativo adeguato, che non sono sempre disponibili e non è favorevole all'induzione a livello sub-tissutale.
In contrasto con tali approcci convenzionali, gli attivatori trascrizionali optogenetici attivati dalla luce hanno il potenziale per un controllo spaziale e temporale più fine dell'espressionegenica 4. Il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu è stato sviluppato e ottimizzato per l'uso in embrioni di zebrafish5,6. Questo sistema si basa su un fattore di trascrizione endogeno attivato dalla luce dal batterio E. litoralis7,8. Il sistema TAEL/C120 è costituito da un attivatore trascrizionale chiamato TAEL che contiene un dominio di transattivazione Kal-TA4, un dominio LOV (light-oxygen-voltage sensing) sensibile alla luce blu e un dominio di legame al DNA helix-turn-helix (HTH)5. Quando illuminati, i domini LOV subiscono un cambiamento conformazionale che consente a due molecole TAEL di dimerizzare, legarsi a un promotore C120 responso al TAEL e avviare la trascrizione di un gene a valle di interesse5,8. Il sistema TAEL/C120 presenta un'induzione rapida e robusta con una tossicità minima e può essere attivato da diverse modalità di erogazione della luce. Recentemente, sono stati apportati miglioramenti al sistema TAEL/C120 aggiungendo un segnale di localizzazione nucleare a TAEL (TAEL-N) e accoppiando l'elemento regolatore C120 a un promotore basale cFos (C120F) (Figura 1A). Queste modifiche hanno migliorato i livelli di induzione di oltre 15 volte6.
In questo protocollo, un semplice pannello LED viene utilizzato per attivare il sistema TAEL/C120 e indurre l'espressione ubiquitaria di un gene reporter, GFP. L'induzione dell'espressione può essere monitorata qualitativamente osservando l'intensità della fluorescenza o quantitativamente misurando i livelli di trascrizione utilizzando la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Questo protocollo dimostrerà il sistema TAEL/C120 come uno strumento versatile e facile da usare che consente una robusta regolazione dell'espressione genica in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BioRender web-based science illustration tool</td>
			<td>BioRender</td>
			<td></td>
			<td>https://biorender.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Color CCD digital camera</td>
			<td>Lumenara</td>
			<td>755-107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4&#34; LCD</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PM100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excitation filter, 545 nm</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>ET545/25x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>illustra RNAspin Mini kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>95017-491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instsant Ocean Sea Salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B017GWDF7E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEARPOW Programmable digital timer switch</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B01G6O28NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fast mix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>101414-286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop image procesing software</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qScript XLT cDNA SuperMix</td>
			<td>Quantabio</td>
			<td>10142-786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 3 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A28137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Cite 120 Fluorescence LED light source</td>
			<td>Excelitas</td>
			<td>010-00326R</td>
			<td>Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light-induced gfp expression in zebrafish embryos using the optogenetic tael/c120 system

I sistemi di espressione genica inducibili sono uno strumento inestimabile per lo studio dei processi biologici. I sistemi di espressione optogenetica possono fornire un controllo preciso sui tempi, la posizione e l'ampiezza dell'espressione genica utilizzando la luce come agente induttore. In questo protocollo, un sistema di espressione optogenetica viene utilizzato per ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish. Questo sistema si basa su un fattore di trascrizione ingegnerizzato chiamato TAEL basato su un fattore di trascrizione attivato dalla luce naturale dal batterio E. litoralis. Quando illuminato con luce blu, TAEL dimerizza, si lega al suo elemento regolatore affine chiamato C120 e attiva la trascrizione. Questo protocollo utilizza embrioni transgenici di zebrafish che esprimono il fattore di trascrizione TAEL sotto il controllo dell'onnipresente promotore ubb. Allo stesso tempo, l'elemento regolatore C120 guida l'espressione di un gene reporter fluorescente (GFP). Utilizzando un semplice pannello LED per fornire luce blu attivante, l'induzione dell'espressione GFP può essere rilevata per la prima volta dopo 30 minuti di illuminazione e raggiunge un picco di oltre 130 volte l'induzione dopo 3 ore di trattamento della luce. L'induzione dell'espressione può essere valutata mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e microscopia a fluorescenza. Questo metodo è un approccio versatile e facile da usare per l'espressione genica optogenetica.

Per questa dimostrazione, una linea reporter GFP C120-responsive (Tg(C120F:GFP)ucm107)) è stata incrociata con una linea transgenica che esprime TAEL-N ubiquitamente dal promotore dell'ubiquitina b (ubb) (Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)) per produrre embrioni transgenici doppi contenenti entrambi gli elementi. 24 ore dopo la fecondazione, gli embrioni sono stati esposti all'attivazione della luce blu, pulsata ad una frequenza di 1 ora on/1 h off. L'induzione dell'espressio...

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Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

L'optogenetica è uno strumento potente con applicazioni ad ampio raggio. Questo protocollo dimostra come ottenere l'espressione genica inducibile dalla luce negli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema TAEL/C120 sensibile alla luce blu.

Espressione GFP indotta dalla luce in embrioni di zebrafish utilizzando il sistema optogenetico TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...

Questo protocollo è significativo perché è un metodo optogenetico, o attivato dalla luce, per indurre l'espressione genica, in un organismo intatto. Nel nostro caso, un embrione di zebrafish. Il vantaggio di questa tecnica, è che utilizza la luce, come agente induttore, che consente un controllo molto preciso, spaziale e temporale dell'induzione.Questo protocollo sarebbe utile per qualsiasi situazione in cui l'espressione genica inducibile sarebbe utile. Ciò include cose come il tracciamento del lignaggio, i saggi di guadagno di funzione o gli esperimenti di salvataggio. Per iniziare posiziona il pannello LED rispetto alle piastre di Petri contenenti embrioni per fornire 1,5 milliwatt per centimetro quadrato di potenza di luce a più embrioni contemporaneamente.Per ridurre il rischio di danni fotografici all'attivatore trascrizionale della coda, inviare la luce a intervalli di un'ora on-off utilizzando un relè timer, se si illumina per più di tre ore. Rimuovere i coperchi della capsula di Petri per ridurre al minimo la dispersione della luce dalla condensa. Posizionare le piastre di Petri contenenti embrioni di controllo e una scatola a prova di luce per i controlli scuri.Rimuovere gli embrioni dall'illuminazione, dopo la durata di attivazione desiderata. Per l'estrazione totale dell'RNA, utilizzare un kit di estrazione dell'RNA. Trasferire gli embrioni in un tubo micro centrifugo da 1,5 millilitri e rimuovere l'acqua dell'uovo in eccesso.Dopo aver aggiunto il tampone di lisi, omogeneizzare gli embrioni con il pestello di plastica. Trasferire il lisiato in una colonna fornita dal kit e seguire le istruzioni del produttore per purificare l'RNA. Conservare l'RNA purificato, a meno 20 a meno 80 gradi Celsius, fino all'uso o sintetizzare immediatamente il cDNA da un microgrammo, RNA totale utilizzando il kit di sintesi del cDNA, seguendo le istruzioni del produttore.Aggiungere un microgrammo di RNA in una parete sottile da 0,2 millilitri, tubo PCR, contenente quattro microlitri, di cinque volte la miscela master di reazione cDNA, seguita dall'aggiunta di un microlitro, di 20 volte soluzione enzimatica di trascrittasi inversa. Successivamente compongono un volume finale di 20 microlitri, con acqua priva di nucleasi. Posizionare il tubo in un termocicclatore programmato per la sintesi del cDNA.Conservare il cDNA sintetizzato a meno 20 gradi Celsius fino all'uso o utilizzare immediatamente per la valutazione quantitativa. Impostare le reazioni quantitative PCR contenenti cyber green enzyme master mix. CDNA e GFP primer a 325 nanomolari a 325 nanomolari in triplicati e conducono la reazione in una macchina PCR programmata in tempo reale.Al termine della reazione, analizzare la curva di fusione per determinare la specificità della reazione. Calcola l'induzione attivata dalla luce come cambiamento di piega rispetto agli embrioni di controllo utilizzando il metodo della doppia TC Delta. E utilizzare software statistico per determinare la significatività.Dopo aver rimosso gli embrioni dall'illuminazione, immobilizzare gli embrioni per l'imaging in 3% di metilcellulosa contenente lo 0,01% di tricaina in vetrini di depressione di vetro. Acquisisci immagini a fluorescenza e in campo luminoso su uno stereomicroscopio fluorescente collegato a una fotocamera digitale utilizzando le impostazioni standard del filtro GFP. Unisci immagini brightfield e fluorescenza dopo l'acquisizione con il software di elaborazione delle immagini.La quantificazione dell'espressione GFP indicava l'induzione dell'espressione non appena 30 minuti dopo l'esposizione alla luce blu. I livelli di espressione della GFP hanno poi continuato ad aumentare fino a sei ore, post-attivazione costantemente. L'induzione della GFP è stata anche valutata qualitativamente esaminando l'intensità della fluorescenza nei punti di tempo post-attivazione.La fluorescenza della GFP al di sopra dei livelli di fondo è stata osservata per la prima volta a tre ore dopo l'attivazione ed è diventata notevolmente più luminosa a sei ore dopo l'attivazione. Al contrario, gli embrioni di controllo per tutti i punti temporali, tenuti al buio, non mostravano alcuna apprezzabile fluorescenza GFP. La luce attivante deve essere nell'intervallo blu dello spettro della luce visibile.Sia la luce della stanza che la luce del sole contengono un po 'di luce blu. Quindi fai attenzione a proteggere i tuoi controlli negativi da qualsiasi fonte di luce ambientale. Il sistema TAEL C120, è geneticamente codificato e modulare e può guidare l'espressione di qualsiasi gene di interesse.Quindi, combinato con altre tecniche, può essere utilizzato per rispondere a una serie di domande biologiche.

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