Name: synthetic antigen controls for immunohistochemistry
Uploaded: 2021-08-23T15:00:00
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Gli autori riconoscono con gratitudine i loro colleghi Jeffrey Tom e Aimin Song per la sintesi peptidica, Nianfeng Ge per la costruzione di TMA, Shari Lau per la colorazione IHC, Melissa Edick per la scansione microscopica digitale e Hai Ngu per la quantificazione digitale delle immagini.

1. Preparazione della soluzione madre e degli strumenti
<ol><li>Preparare 20 mL di una soluzione BSA al 25% p/v mescolando 5 g di polvere di BSA in 14 mL di PBS, pH 7,2 in un tubo conico da 50 mL fino a disperdersi uniformemente. Vortice se necessario per disperdere la polvere BSA.<ol><li>Conservare la soluzione per una notte a 4 °C per consentire la completa dissoluzione. Regolare il volume finale a 20 ml con PBS per creare una soluzione stock al 25% p/v.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare 20 mL di una soluzione di BSA ...

<ol>
	<li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+positive+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+International+Ad+Hoc+Expert+Committee.">Standardization of positive controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the International Ad Hoc Expert Committee.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 23 (1), 1-18 (2015).</li><li>H&#246;tzel, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+antigen+gels+as+practical+controls+for+standardized+and+quantitative+immunohistochemistry.">Synthetic antigen gels as practical controls for standardized and quantitative immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 67 (5), 309-334 (2019).</li><li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controls+for+immunohistochemistry:+The+histochemical+society's+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays.">Controls for immunohistochemistry: The histochemical society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li><li>Torlakovic, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+negative+controls+in+diagnostic+immunohistochemistry:+recommendations+from+the+international+ad+hoc+expert+panel.">Standardization of negative controls in diagnostic immunohistochemistry: recommendations from the international ad hoc expert panel.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 22 (4), 241-252 (2014).</li><li>Martinez-Morilla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+PD-L1+as+an+analyte+in+immunohistochemistry+diagnostic+assays+using+a+standardized+cell+line+tissue+microarray.">Quantitative assessment of PD-L1 as an analyte in immunohistochemistry diagnostic assays using a standardized cell line tissue microarray.</a> Laboratory Investigation. 100, 4-15 (2020).</li><li>Ben-David, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+transcriptional+evolution+alters+cancer+cell+line+drug+response.">Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response.</a> Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+peptides+identified+from+phage-displayed+combinatorial+libraries+as+immunodiagnostic+assay+surrogate+quality-control+targets.">Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.</a> Clinical Chemistry. 48 (3), 410-420 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+quality+control+slide+for+quantitative+immunohistochemistry+testing.">A novel quality control slide for quantitative immunohistochemistry testing.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (11), 1425-1433 (2002).</li><li>Sompuram, S. R., Vani, K., Tracey, B., Kamstock, D. A., Bogen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+immunohistochemistry:+A+new+reference+control+for+detecting+staining+problems.">Standardizing immunohistochemistry: A new reference control for detecting staining problems.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (9), 681-690 (2015).</li><li>Vani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Levey-Jennings+analysis+uncovers+unsuspected+causes+of+immunohistochemistry+stain+variability.">Levey-Jennings analysis uncovers unsuspected causes of immunohistochemistry stain variability.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 24 (10), 688-694 (2016).</li><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+immunofluorescence+with+artificial+sections+of+selected+antigenicity.">Evaluation of immunofluorescence with artificial sections of selected antigenicity.</a> Immunology. 22, 177-183 (1972).</li><li>Matute, C., Streit, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+demonstrating+GABA-Iike+immunoreactivity.">Monoclonal antibodies demonstrating GABA-Iike immunoreactivity.</a> Histochemistry. 86, 147-157 (1986).</li><li>Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembedding+light-+and+electron+microscopic+immunocytochemistry+of+amino+acids:+description+of+a+new+model+system+allowing+identical+conditions+for+specificity+testing+and+tissue+processing.">Postembedding light- and electron microscopic immunocytochemistry of amino acids: description of a new model system allowing identical conditions for specificity testing and tissue processing.</a> Experimental Brain Research. 69, 167-174 (1987).</li><li>Fowler, C. B., Cunningham, R. E., O'Leary, T. J., Mason, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Tissue+surrogates'+as+a+model+for+archival+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues.">'Tissue surrogates' as a model for archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Laboratory Investigation. 87, 836-846 (2007).</li><li>Arabi, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+albumin+hydrogels+in+broad+pH+and+temperature+ranges:+characterization+of+their+self-assembled+structures+and+nanoscopic+and+macroscopic+properties.">Serum albumin hydrogels in broad pH and temperature ranges: characterization of their self-assembled structures and nanoscopic and macroscopic properties.</a> Biomaterials Science. 6 (3), 478-492 (2018).</li><li>Schrohl, A. -. S., Pedersen, H. C., Jensen, S. S., Nielsen, S. L., Br&#252;nner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+epidermal+growth+factor+receptor+2+(HER2)+immunoreactivity:+specificity+of+three+pharmacodiagnostic+antibodies.">Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) immunoreactivity: specificity of three pharmacodiagnostic antibodies.</a> Histopathology. 59, 975-983 (2011).</li><li>Lear, S., Cobb, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pep-Calc.com:+a+set+of+web+utilities+for+the+calculation+of+peptide+and+peptoid+properties+and+automatic+mass+spectral+peak+assignment.">Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 30, 271-277 (2016).</li><li>Camp, R. L., Chung, G. G., Rimm, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+subcellular+localization+and+quantification+of+protein+expression+in+tissue+microarrays.">Automated subcellular localization and quantification of protein expression in tissue microarrays.</a> Nature Medicine. 8 (11), 1323-1327 (2002).</li><li>Angelo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+ion+beam+imaging+of+human+breast+tumors.">Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors.</a> Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).</li><li>Buus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+of+linear+antibody+epitopes+using+ultrahigh-density+peptide+microarrays.">High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+epitope+mapping+of+antibodies+using+ultra-dense+peptide+arrays.">Proteome-wide epitope mapping of antibodies using ultra-dense peptide arrays.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 13 (6), 1585-1597 (2014).</li><li>Forsstr&#246;m, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+antibodies+with+regards+to+linear+and+conformational+epitopes.">Dissecting antibodies with regards to linear and conformational epitopes.</a> PLoS One. 10 (3), 0121673 (2015).</li><li>Prasad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+consensus+on+applying+quantitative+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+proteomics+in+translational+pharmacology+research:+A+white+paper.">Toward a consensus on applying quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometry proteomics in translational pharmacology research: A white paper.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 106 (3), 525-543 (2019).</li></ol>

Questo metodo consente all'utente di creare campioni uniformi di composizione nota e concentrazione di antigene come standard nelle reazioni IHC, utilizzando materiali e tecniche familiari alla maggior parte dei laboratori di istologia. Il passo più cruciale è identificare l'epitopo a cui si lega l'anticorpo di interesse. Questo protocollo descrive l'utilizzo di un antigene peptidico lineare dall'ICD ERBB2/HER2. Lo stesso protocollo può essere utilizzato per formare gel BSA contenenti oligonucleotidi, etichette fluore...

L'immunoistochimica (IHC) consente il rilevamento sensibile e specifico, spazialmente preciso di antigeni bersaglio in sezioni di tessuto fissate in formalina, incorporate in paraffina (FFPE). Tuttavia, i risultati della colorazione IHC possono essere influenzati da più variabili, tra cui il tempo di ischemia calda e fredda, la fissazione dei tessuti, il pretrattamento dei tessuti, la reattività e la concentrazione degli anticorpi, la chimica di rilevamento del saggio e i tempi di reazione1. Di conseguenza, le prestazioni riproducibili e l'interpretazione delle reazioni IHC richiedono un controllo rigoroso di queste variabili e l'uso di campioni di controllo positivi e negativi ben caratterizzati. I controlli frequentemente utilizzati includono tessuti incorporati in paraffina o linee cellulari in coltura conosciute da analisi indipendenti per esprimere l'antigene di interesse, ma tali campioni non sono sempre disponibili1. Inoltre, i livelli di espressione degli antigeni bersaglio nei tessuti e nei controlli delle linee cellulari sono generalmente compresi solo qualitativamente e possono essere variabili. I controlli contenenti concentrazioni riproducibili e note con precisione dell'antigene bersaglio possono aiutare nell'ottimizzazione delle condizioni di reazione IHC. Un metodo generale, adattabile a una varietà di tipi di antigene in un intervallo fisiologicamente rilevante di concentrazioni per creare campioni sintetici di controllo IHC, è stato descritto dagli autori2. Un protocollo dettagliato è fornito qui per la creazione e l'uso di questo tipo di standard.
Controlli appropriati sono essenziali per la valida interpretazione dei saggi IHC 1,3,4. Tessuti, cellule coltivate e substrati rivestiti di peptidi sono stati impiegati come controlli IHC in base alle esigenze specifiche dei ricercatori. I vantaggi e le limitazioni inerenti all'uso dei tessuti come controlli IHC sono stati ampiamente discussi 1,4. Per molti anticorpi, è possibile scegliere controlli appropriati tra tessuti normali selezionati contenenti popolazioni cellulari che esprimono l'antigene bersaglio in un ampio intervallo dinamico. I controlli tissutali sono meno adatti quando l'antigene bersaglio non è ben caratterizzato per quanto riguarda il sito di espressione o l'abbondanza, o quando gli antigeni potenzialmente a reazione incrociata sono co-espressi nelle stesse cellule o siti tissutali. In questi contesti, blocchi di linee cellulari in coltura che esprimono l'antigene di interesse possono essere utili. Per fornire ulteriori prove della specificità del bersaglio, le linee cellulari possono essere progettate per sovra-o sotto-esprimere antigeni bersaglio. Ad esempio, tale approccio è stato recentemente utilizzato per valutare una varietà di saggi anti-PD-L1 utilizzando un microarray tissutale di linee cellulari isogeniche che esprimono una gamma di antigene PD-L15. Le limitazioni pratiche all'uso di routine dei blocchi di linee cellulari includono il costo e il tempo necessari per produrre un numero di cellule sufficiente e il fatto che l'espressione di alcuni antigeni potrebbe non essere coerente in modo affidabile, anche all'interno delle linee cellulari clonali6. I peptidi sintetici sono una terza opzione per i controlli IHC per gli anticorpi che riconoscono gli epitopi lineari corti. Steven Bogen e colleghi hanno pubblicato ampiamente sull'uso di peptidi accoppiati alla superficie di vetrini 7,8 e perle di vetro9. Uno studio di questo gruppo ha dimostrato che l'analisi quantitativa dei controlli IHC basati su peptidi potrebbe rilevare la variazione del processo di colorazione mancata dalla valutazione qualitativa dei controlli tissutali analizzati in parallelo10. Mentre gli standard che utilizzano antigeni basati su perline potrebbero essere ampiamente applicabili, molti dettagli sono proprietari degli autori, limitando l'adozione diffusa.
Un altro approccio agli standard IHC incorpora antigeni bersaglio in gel proteici creati artificialmente. Questo concetto è stato dimostrato per la prima volta da Per Brandtzaeg nel 1972 in uno studio in cui il normale siero di coniglio è stato polimerizzato usando glutaraldeide11. Piccoli blocchi del gel risultante sono stati poi immersi per 1-4 settimane in soluzioni contenenti gli antigeni immunoglobuline di interesse a varie concentrazioni. Dopo la fissazione dell'alcol e l'incorporazione della paraffina, è stato dimostrato che sezioni dei controlli risultanti si coloravano con intensità corrispondenti al logaritmo delle soluzioni antigeniche in cui erano state immerse. Successivamente, i ricercatori hanno preparato coniugati di glutaraldeide di aminoacidi specifici in BSA diluito o soluzioni omogenee cerebrali come controlli positivi negli studi di microscopia immuno-elettronica12,13. Lavori più recenti hanno studiato l'uso di gel a base di soluzioni proteiche fissate alla formaldeide come surrogati del tessuto FFPE nell'analisi di spettrometria di massa14. Un altro lavoro recente ha studiato la struttura e le proprietà dei gel formati riscaldando soluzioni di albumina sierica umana o bovina a varie concentrazioni e pH15. Questi autori hanno scoperto che l'albumina sierica forma tre tipi di gel che differiscono per elasticità meccanica, conservazione della struttura secondaria e capacità di legame con gli acidi grassi a seconda delle condizioni sperimentali. Insieme, questi documenti dimostrano la fattibilità generale dell'approccio qui impiegato. Le soluzioni proteiche di composizione definita creano gel simili a tessuti che possono essere ulteriormente elaborati, sezionati e colorati utilizzando metodi istologici di routine.
Questo protocollo descrive la formazione di un controllo IHC sintetico a base di albumina sierica bovina (BSA) polimerizzata con calore e formaldeide. I gel possono incorporare un'ampia varietà di antigeni, tra cui proteine a lunghezza intera, domini proteici e peptidi lineari, nonché antigeni non proteici tra cui oligonucleotidi2. Questa dimostrazione utilizza un antigene di esempio un peptide lineare che codifica per gli amminoacidi C-terminal 16 della proteina umana ERBB2 (HER2/neu) TPTAENPEYLGLDVPV-COOH (vedi Tabella dei materiali). Questa sequenza include gli epitopi riconosciuti da tre anticorpi diagnosticamente rilevanti disponibili in commercio, tra cui il reagente policlonale Herceptest (ENPEYLGLDVP) e gli anticorpi monoclonali CB11 (AENPEYL) e 4B5 (TAENPEYLGL) (vedi Tabella dei materiali)16.
Il metodo qui dimostrato impiega reagenti prontamente disponibili utilizzando processi e tecniche familiari a qualsiasi laboratorio di istologia praticante. La limitazione più significativa è la necessità di identificare e acquistare gli antigeni bersaglio, che può essere realizzato in molti casi a un costo relativamente modesto. Poiché questi controlli sintetici sono di composizione completamente definita e realizzati con metodi semplici, possono essere implementati in molti laboratori con risultati riproducibili. Il loro uso può facilitare la valutazione oggettiva e quantificabile dei risultati della colorazione IHC e consentire una maggiore riproducibilità intra e interlaboratorio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-HER2/neu clone 4B5</td>
			<td>Ventana</td>
			<td>5278368001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Wraps</td>
			<td>Leica</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin, ultra pure</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>BSA #9998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold (15 mm x 15 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable base mold 
			(24 mm x 24 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>22-363-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>80081-188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ERBB2 / HER2 peptide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>UniProt P04626-1; a.a. 1240-55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stir Bar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16004-128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free microfuge tubes 1.5 mL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast paraffin</td>
			<td>Leica</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide parameter calculator</td>
			<td>Pep-Calc17</td>
			<td>https://www.pep-calc.com/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide suppliers</td>
			<td>ABclonal Science</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Anaspec Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>CPC Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>New England Peptide</td>
			<td></td>
			<td>Users should contact peptide vendors for details of mass, purity and cost.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline pH 7.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent Alcohol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>9111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMA Tissue Grand Master</td>
			<td>3DHISTECH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthetic antigen controls for immunohistochemistry

I saggi di immunoistochimica (IHC) forniscono preziose informazioni sui modelli di espressione proteica, la cui interpretazione affidabile richiede campioni di controllo positivi e negativi ben caratterizzati. Poiché non sono sempre disponibili controlli appropriati per tessuti o linee cellulari, un metodo semplice per creare controlli IHC sintetici può essere utile. Tale metodo è descritto qui. È adattabile a vari tipi di antigene, tra cui proteine, peptidi o oligonucleotidi, in una vasta gamma di concentrazioni. Questo protocollo spiega i passaggi necessari per creare controlli dell'antigene sintetico, utilizzando come esempio un peptide dal dominio intracellulare (ICD) dell'oncogene eritroblastico umano B2 (ERBB2/HER2) riconosciuto da una varietà di anticorpi diagnosticamente rilevanti. Le diluizioni seriali del peptide HER2 ICD in soluzione di albumina sierica bovina (BSA) vengono miscelate con formaldeide e riscaldate per 10 minuti a 85 °C per solidificare e reticolare la miscela peptide/BSA. Il gel risultante può essere lavorato, sezionato e colorato come un tessuto, producendo una serie di campioni di concentrazioni di antigene note che coprono una vasta gamma di intensità di colorazione.
Questo semplice protocollo è coerente con le procedure di laboratorio di istologia di routine. Il metodo richiede solo che l'utente abbia una quantità sufficiente dell'antigene desiderato. Proteine ricombinanti, domini proteici o peptidi lineari che codificano epitopi rilevanti possono essere sintetizzati localmente o commercialmente. I laboratori che generano anticorpi interni possono riservare aliquote dell'antigene immunizzante come bersaglio di controllo sintetico. L'opportunità di creare controlli positivi ben definiti su una vasta gamma di concentrazioni consente agli utenti di valutare le prestazioni dei test intra e interlaboratorio, ottenere informazioni sulla gamma dinamica e la linearità dei loro saggi e ottimizzare le condizioni di analisi per i loro particolari obiettivi sperimentali.

I peptidi devono dissolversi completamente in un solvente appropriato a temperatura ambiente per formare una soluzione otticamente chiara. Se il particolato visibile è ancora presente dopo 30-60 minuti, può essere utile aggiungere ulteriori volumi del solvente originale o di un solvente alternativo non superiore al volume previsto della soluzione madre peptidica 5x calcolata nella Tabella 1. Allo stesso modo, la soluzione combinata peptide/BSA deve rimanere traslucida (Figura 1A</s...

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Synthetic Antigen Controls for Immunohistochemistry

Questo lavoro documenta un metodo semplice per creare controlli di antigeni sintetici per l'immunoistochimica. La tecnica è adattabile a una varietà di antigeni in una vasta gamma di concentrazioni. I campioni forniscono un riferimento con cui valutare le prestazioni e la riproducibilità intra e inter-test.

Controlli dell'antigene sintetico per l'immunoistochimica

Immunohistochemistry (IHC) assays provide valuable insights into protein expression patterns, the reliable interpretation of which requires ...

I gel antigenici BSA sono standard IHC riproducibili ben caratterizzati che possono integrare i controlli esistenti. Questo protocollo utilizza istologia standard e reagenti e metodi IHC per rendere riproducibili standard di composizione nota. Questi controlli offrono l'opportunità a diversi laboratori di calibrare e standardizzare i saggi IHC per molti test diagnosticamente rilevanti.È importante trovare un solvente adatto per sciogliere il peptide o la proteina. Può essere difficile mescolare rapidamente soluzioni di antigene e formaldeide senza introdurre bolle. Per iniziare, preparare 20 millilitri di una soluzione BSA al 25% peso in volume mescolando cinque grammi di polvere BSA in 14 millilitri di PBS, in un tubo conico da 50 millilitri fino a distribuzione uniforme.Vortex la soluzione per sciogliere la polvere BSA. Mantenere la soluzione durante la notte a quattro gradi Celsius per una completa dissoluzione. Il giorno seguente, regolare il volume finale a 20 millilitri con PBS.Allo stesso modo, preparare 20 millilitri di una soluzione BSA al 31,3% peso in volume mescolando 6,26 grammi di polvere BSA in 13 millilitri di PBS. Dopo l'incubazione notturna per la completa dissoluzione, regolare il volume finale a 20 millilitri con PBS. Per verificare che la miscela di formaldeide BSA formi un gel, preriscaldare un blocco di calore a 85 gradi Celsius.Quindi mescolare 700 microlitri della soluzione al 25% BSA con 700 microlitri di formaldeide al 37%. Mescolare bene pipettando su e giù cinque volte entro cinque-10 secondi senza creare bolle d'aria. Immediatamente dopo la miscelazione, posizionare il tubo di microcentrifuga chiuso nel blocco termico preriscaldato a 85 gradi Celsius.Dopo 10 minuti, rimuovere il tubo dal blocco termico. Lasciare raffreddare e confermare che il gel si è formato come previsto. Preparare ed etichettare chiaramente otto tubi da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Quindi preparare una soluzione madre di peptide 5x, aggiungere una concentrazione di 12,5 millimolari risospendendo l'intera massa del peptide liberalizzato in 60 microlitri del solvente appropriato. Osservare la soluzione per assicurarsi che il peptide sia completamente dissolto. Quindi aggiungere un ulteriore volume di solvente se necessario per ottenere una soluzione da 12,5 millimolari in base al peso molecolare dei peptidi, alla massa e alla purezza.In questo esempio, lo stock di peptidi 5x ha un volume finale di 626,9 microlitri. Altri campioni di peptidi richiederanno un volume finale diverso. Quindi, preparare 150 microlitri di una soluzione madre di peptide 1x aggiungere una concentrazione di 2,5 millimolari diluendo 30 microlitri dello stock di peptidi 5x in 120 microlitri di solvente.Vortice la soluzione per cinque secondi e centrifugare a temperatura ambiente. Quindi, preparare 700 microlitri di una soluzione di peptide BSA 0,5 millimolare diluendo 140 microlitri dello stock di peptidi 1x in 560 microlitri della soluzione BSA al 31,3%. Dopo il vortice, centrifugare la soluzione a temperatura ambiente.Allo stesso modo, preparare quattro successive diluizioni seriali 10x del calcio peptidico BSA aggiungendo 70 microlitri della soluzione peptidica BSA a 630 microlitri della soluzione di BSA al 25%. Per preparare i gel peptidici BSA, aggiungere il 37% di formaldeide alle diluizioni peptidiche BSA in un rapporto uno a uno lavorando un campione alla volta. Mescolare bene pipettando su e giù cinque volte entro cinque-10 secondi senza creare bolle d'aria.Dopo la miscelazione, posizionare il tubo di microcentrifuga chiuso in un blocco termico a 85 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo che tutte le soluzioni di peptide BSA e formaldeide sono state preparate e riscaldate, lasciare raffreddare i gel sul banco per cinque o 10 minuti. Successivamente, utilizzando una spatola da laboratorio usa e getta pulita e flessibile, rimuovere il campione di gel dal tubo della microcentrifuga in un unico pezzo.E metterlo in un contenitore sigillato contenente almeno 15 millilitri di formalina tamponata neutra, utilizzando un contenitore separato per ciascun campione. In alternativa, utilizzando una nuova lama a filo singolo, tagliare il fondo del tubo della microcentrifuga e spingere il gel fuori dal fondo con aria o una sonda adatta. Utilizzando un rasoio pulito a taglio singolo, tagliare il cono di gel in dischi cilindrici di circa cinque millimetri di spessore.Dopo aver avvolto i dischi in un involucro per biopsia, posizionare un disco di gel più grande in una cassetta e i dischi di gel rimanenti insieme in una seconda cassetta per l'uso nella costruzione di microarray tissutali. Prima della lavorazione, posizionare i gel della cassetta in almeno 15 millilitri di formalina tamponata neutra al 10% per gel, utilizzando un contenitore separato per ciascun campione. Successivamente, elaborare i gel in un processore tissutale istologico automatizzato seguendo un ampio programma di tessuti con pressione e vuoto.Al termine dell'elaborazione del campione, rimuovere le cassette dal processore di tessuti e spostarle nel centro di incorporazione della paraffina. Dopo aver scartato i gel dall'involucro della biopsia, incorporare i gel in paraffina o ogni campione incorporare un disco di gel in un piccolo stampo da 15 per 15 millimetri. E i dischi di gel rimanenti insieme in un secondo stampo più grande.Per ogni serie di diluizione peptidica, creare due vetrini contenenti un totale di sei sezioni separate. Una sezione da ciascuno dei cinque campioni della serie di diluizione e una sezione dal campione di controllo negativo BSA. Dopo aver sezionato e asciugato i vetrini, colorare i due vetrini preparati per ciascun peptide con l'anticorpo primario desiderato.Secondo i protocolli standard di immunoistochimica ci si aspetta di vedere un segnale relativamente uniforme all'interno di ogni sezione di gel. Con i diversi campioni di gel che mostrano un intervallo di intensità del segnale corrispondente alle diluizioni peptidiche. Per la costruzione del microarray di tessuto gel BSA, tagliare sezioni spesse quattro micrometri del microarray tissutale e colorare con un anticorpo monoclonale di coniglio secondo i protocolli standard di laboratorio.Valutare qualitativamente l'intensità della macchia risultante mediante ispezione o acquistare quantitativamente la scansione e l'analisi delle immagini digitali. Dopo aver reagito con gli anticorpi appropriati, i campioni di gel BSA di controllo negativo hanno mostrato un segnale minimo. L'intensità del segnale in un singolo campione di gel è relativamente uniforme e aumenta con l'aumentare delle concentrazioni di antigene.Più del 10% delle cellule MDA-MB-175 mostra una colorazione membranosa debole e completamente circonferenziale. Al contrario, più del 10% delle cellule SKBR-3, mostrano un'intensa colorazione membranosa completamente circonferenziale Lavorare rapidamente una volta aggiunta la formaldeide perché le soluzioni inizieranno a gelificare anche a temperatura ambiente. Usiamo questo metodo per effettuare controlli IHC durante il test di nuovi anticorpi per darci la certezza che il test ha funzionato come previsto, anche quando gli anticorpi del test non mostrano alcun segnale.I controlli dei tessuti o delle linee cellulari sono intrinsecamente variabili. I controlli sintetici dell'antigene ci consentono di misurare l'effetto del cambiamento di specifiche condizioni di reazione ISD in modo più preciso.

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