Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

نود أن نشكر الدكتور روبرت م. كوتين (المعهد الوطني للقلب والدم والرئة، المعاهد القومية للصحة) على توفير بسخاء لنا البلازميدات AAV ودانييل ستيل وريبيكا ارنست (مستشفى سينسيناتي للأطفال) لمساعدتهم التقنية. ويدعم هذا العمل صندوق بدء التشغيل من مؤسسة سينسيناتي لأبحاث الأطفال إلى M.N.

انظر الشكل 1 للحصول على رسم توضيحي يلخص البروتوكول.
1. جيل من خلايا TIPS المصابة بفيروس باكولو
<ol><li>تذوب قارورة واحدة من خلايا Sf9 وبذورها على الفور في 50 مل من وسيطة زراعة خلايا الحشرات. تنمو خلايا Sf9 في حاضنة شاكر المدارية في 125 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية في قو?...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

يمكن تطبيق المعلمات المستخدمة في هذا البروتوكول لتطوير عملية إنتاج وتنقية وتركيز ناقلات AAV على كل من التصنيع الصغير والكبير لنواقل AAV لتطبيقات العلاج الجيني. يمكن تنفيذ عملية المنبع والمصب بالكامل في نظام مغلق متوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP). المزايا الرئيسية لنظام الفيروسا...

الفيروسات المرتبطة أدينو (AAV) هي غير مغلفة parvoviruses الإنسان التي تحتوي على الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل من 4.6 kb. ناقلات AAV لها العديد من المزايا على ناقلات الفيروسية الأخرى لتطبيقات العلاج الجيني1،2،3،4. AAVs بشكل طبيعي النسخ المتماثل غير كفء، وبالتالي، تتطلب فيروس مساعد والآلات المضيفة للنسخ المتماثل. AAVs لا تسبب أي مرض وانخفاض المناعة في المضيف المصاب3،5. AAV يمكن أن تصيب كل من الخلايا هادئة وتقسيم بنشاط ويمكن أن تستمر كما episome دون الاندماج في الجينوم من الخلايا المضيفة (AAV نادرا ما تدمج في الجينوم المضيف)1،3. جعلت هذه الميزات AAV أداة مرغوبة لتطبيقات العلاج الجيني.
لتوليد ناقل نقل الجينات AAV، يتم استنساخ كاسيت المتحولين جنسيا، بما في ذلك الجين العلاجي، بين اثنين من التكرارات الطرفية الداخلية (ITRs)، والتي عادة ما تكون مشتقة من النمط المصلي AAV 2. الحد الأقصى لحجم من 5 'ITR إلى 3' ITR، بما في ذلك تسلسل transgene، هو 4.6 كيلو بايت6. قد يكون لدى القبعات المختلفة خلية أو أنسجة مختلفة. لذلك ، يجب اختيار capsids استنادا إلى نوع الأنسجة أو الخلية المقصود استهدافه بمتجه AAV7.
وعادة ما تنتج ناقلات AAV المؤتلفة في خطوط خلايا الثدييات مثل خلايا الكلى الجنينية البشرية، HEK293 عن طريق العدوى العابرة لنقل نقل الجينات AAV، AAV إعادة الغطاء، ومساعد فيروس plasmids2،3. ومع ذلك، هناك العديد من القيود لإنتاج AAV على نطاق واسع عن طريق العدوى العابرة للخلايا HEK293 الملتصقة. أولا، هناك حاجة إلى عدد كبير من مداخن الخلايا أو زجاجات الأسطوانة. ثانيا، هناك حاجة إلى الحمض النووي عالي الجودة وواشف العدوى، مما يزيد من تكلفة التصنيع. وأخيرا، عند استخدام خلايا HEK293 الملتصقة، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى المصل لإنتاج الأمثل، مما يعقد معالجة المصب1،2،3. طريقة بديلة لتصنيع AAV ينطوي على استخدام خط الخلية الحشرية، Spodoptera frugiperda (Sf9) الخلايا، وفيروس حشرة يسمى المؤتلف أوتوغرافا californica فيروس متعدد الكبسولات النووية متعددة الخلايا (AcMNPV أو فيروس baculovirus)8،9،10. تزرع خلايا Sf9 في ثقافة التعليق الخالية من المصل التي يسهل توسيع نطاقها وتتوافق مع إنتاج ممارسة التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) على نطاق واسع ، والتي لا تتطلب بلازميد أو كاشفات العدوى. وعلاوة على ذلك، فإن تكلفة إنتاج AAV باستخدام نظام الفيروسات الكولوية Sf9 أقل من تكلفة استخدام العدوى العابرة للبلازميدات في خلايا HEK29311.
استخدم نظام إنتاج rAAV الأصلي باستخدام خلايا baculovirus-Sf9 ثلاثة فيروسات باكولو: فيروس باكولو واحد يحتوي على كاسيت نقل الجينات ، والثاني فيروس باكولو يحتوي على جين مندوب ، والثالث فيروس باكولو يحتوي على جين capsid خاص بالنمط المصلي12،13. ومع ذلك ، كان فيروس الباكولو الذي يحتوي على بناء مندوب غير مستقر وراثيا عند جولات متعددة من الممرات ، مما منع تضخيم فيروس الباكولو لإنتاج AAV على نطاق واسع. لحل هذه المشكلة، تم تطوير نظام ناقلات rAAV جديدة، والتي تحتوي على اثنين من الفيروسات الكولوجينية (TwoBac): واحد baculovirus تحتوي على كاسيت نقل الجينات AAV وآخر baculovirus تحتوي على الجينات AAV إعادة الغطاء معا والتي هي وراثيا أكثر استقرارا من النظام الأصلي وأكثر ملاءمة لإنتاج rAAV بسبب استخدام TwoBac بدلا من ثلاثة14، 15. يستخدم نظام OneBac كاسيت نقل الجينات AAV وجينات إعادة الغطاء في فيروس باكولو واحد وهو أكثر ملاءمة لإنتاج rAAV بسبب استخدام فيروس باكولو واحد بدلا من استخدام TwoBac أو ThreeBac2،16،17. في دراستنا ، تم استخدام نظام TwoBac للتحسين.
نظام الفيروسات الكولوية لإنتاج AAV له أيضا قيود: جزيئات فيروس الكولو غير مستقرة للتخزين على المدى الطويل في المتوسط الخالي من المصل11، وإذا كان تاتر فيروس الباكولو منخفضا ، ف هناك حاجة إلى كمية كبيرة من الفيروس الكولوفيروسي الفائق ، والتي قد تصبح سامة لنمو خلايا Sf9 أثناء إنتاج AAV (الملاحظة الشخصية). استخدام خلايا الحفاظ على الخلايا المصابة أقل تيتر وتوسيع نطاق (TIPS) الخلايا، أو خلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو (BIIC)، ويوفر خيارا جيدا لإنتاج AAV التي يتم إعداد خلايا Sf9 المصابة بفيروس الباكولو، cryopreserved، وتستخدم في وقت لاحق لعدوى خلايا Sf9 الطازجة. ميزة أخرى هي زيادة استقرار فيروس الباكولو (BV) في خلايا Sf9 بعد التبريد10،11.
يتم إنشاء نوعين من خلايا TIPS لتمكين إنتاج AAV: الأول عن طريق عدوى خلايا Sf9 مع BV-AAV2-GFP أو الجين العلاجي ، والثاني عن طريق عدوى خلية Sf9 مع BV-AAV2-rep-cap. يتم تقديم خلايا TIPS في الاقتباسات الصغيرة والجاهزة للاستخدام. يتم إنتاج ناقلات AAV في ثقافة التعليق الخالية من المصل في قارورة توضع في شاكر مداري أو مفاعل حيوي Wave عن طريق زراعة خلايا TIPS المشتركة التي تنتج الفيروسات الكولوئية وخلايا Sf9 الطازجة. يتم إصابة خلايا Sf9 بفيروسات الباكولو التي تحمل ناقل AAV2-GFP وتسلسلات إعادة الغطاء لتوليد AAV. بعد أربعة إلى خمسة أيام ، عندما تكون عوائد AAV هي الأعلى ، يتم زفر الخلايا المنتجة بالمنظفات لإطلاق جزيئات AAV. يتم توضيح lysate الخلية في وقت لاحق عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة والترشيح. يتم تنقية جزيئات AAV من اللستات بواسطة الكروماتوغرافيا عمود AVB Sepharose. وأخيرا، تتركز ناقلات AAV باستخدام TFF. يصف البروتوكول إنتاج AAV على نطاق صغير ، مفيد للأبحاث والدراسات ما قبل السريرية. ومع ذلك ، فإن الأساليب قابلة للتطوير ومتوافقة مع تصنيع ناقلات AAV من الدرجة السريرية لتطبيقات العلاج الجيني.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

تعد الفيروسات المرتبطة بالأدينو (AAV) ناقلات واعدة لتطبيقات العلاج الجيني. هنا، يتم إنتاج ناقلات AAV2 من قبل الثقافة المشتركة للخلايا Spodoptera frugiperda (Sf9) مع خلايا Sf9 المصابة بفيروس الباكولو (BV) - AAV2 - GFP (أو الجينات العلاجية) وBV-AAV2-rep-cap في ثقافة التعليق الخالية من المصل. يتم استزراع الخلايا في قارورة في شاكر مداري أو مفاعل حيوي للموجة. لإطلاق جزيئات AAV ، يتم lysed الخلايا المنتجة في العازلة التي تحتوي على المنظفات ، والتي يتم توضيحها لاحقا عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة والترشيح. يتم تنقية جزيئات AAV من lysate الخلية باستخدام الكروماتوغرافيا عمود AVB Sepharose ، الذي يربط جزيئات AAV. يتم غسل الجسيمات المقيدة مع برنامج تلفزيوني لإزالة الملوثات و eluted من الراتنج باستخدام العازلة سيترات الصوديوم في pH 3.0. يتم تحييد الإيلوات الحمضي مع العازلة القلوية Tris-HCl (درجة الحموضة 8.0)، المخفف مع المالحة العازلة بالفوسفات (PBS)، وتتركز بشكل أكبر مع ترشيح التدفق العرضي (TFF). يصف البروتوكول إنتاج ناقلات ما قبل السريرية على نطاق صغير متوافق مع التوسع في تصنيع AAV على نطاق واسع من الدرجة السريرية لتطبيقات العلاج الجيني البشري.

هنا ، تظهر النتائج التمثيلية لتطوير العملية لإنتاج وتنقية ناقلات AAV باستخدام نظام خلايا الحشرات Sf9. وتشمل هذه الطريقة الثقافة المشتركة للخلايا SF9 مع خلايا TIPS المصابة بفيروس الكولو، وتغذية الخلايا مع متوسط النمو، والحصاد وتحلل الخلايا المنتجة للافراج عن جزيئات AAV، وتوضيح ليسات الخلية مع ع?...

Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

في هذا البروتوكول ، يتم إنتاج ناقل AAV2 عن طريق زراعة خلايا الحشرات Spodoptera frugiperda (Sf9) مع فيروس الكولو (BV) - AAV2 - بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) أو الجين العلاجي وBV-AAV2-rep-cap المصابة خلايا Sf9 في ثقافة التعليق. يتم تحرير جزيئات AAV من الخلايا باستخدام المنظفات ، وتوضيحها ، وتنقيتها عن طريق الكروماتوغرافيا عمود تقارب ، وتتركز عن طريق ترشيح تدفق عرضي.

تطوير عملية إنتاج وتنقية الفيروسات المرتبطة أدينو (AAV)2 ناقلات باستخدام نظام زراعة خلايا فيروس الحشرات Baculovirus

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

سيكون هذا البروتوكول مفيدا للمحققين الذين يرغبون في تطوير طرق لإنتاج وتنقية AAV باستخدام نظام زراعة خلايا فيروس الحشرات الباكولو. إنتاج AAV باستخدام نظام زراعة خلايا فيروس الحشرات الباكولو هو طريقة فعالة من حيث التكلفة يسهل توسيع نطاقها وتتوافق مع ممارسة التصنيع الجيدة الحالية. بعض أجزاء البروتوكول سيبرهن عليها (آلان هايزر)، مساعد باحث في مختبري.تبدأ عن طريق إذابة قارورة واحدة من خلايا Sf9 ، والبذور على الفور لهم في 15 ملليلتر من الخلايا الحشرية ثقافة المتوسطة. تنمو خلايا Sf9 في حاضنة شاكر المدارية في 125 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية في قوارير مستديرة القاع مع غطاء فضفاض المرفقة لتبادل الهواء. نشر الخلايا في قارورة لتر واحد تحتوي على 200 ملليلتر من المتوسطة للحصول على ما يكفي من الخلايا لإنتاج الخلايا TIPS.أضف 50 ملليلتر من خلايا Sf9 بمعدل 2 × 10 إلى خلايا الطاقة السادسة لكل ملليلتر في قارورتين. تصيب قارورة واحدة من خلايا SF9 مع 0.5 ملليلتر من baculovirus-AAV2-GFP، وقارورة أخرى من الخلايا مع 0.5 ملليلتر من baculovirus-AAV2-rep-cap. بعد ثلاثة أيام، حصاد aliquot صغيرة من خلايا Sf9 المصابة بفيروس الكولو، والمعروف أيضا باسم خلايا TIPS.وصمة عار 2 مرات 10 إلى السلطة 5 من كل من الخلايا SF9 غير المصابة وفيروس baculo مع 0.5 ميكروغرام من الأجسام المضادة للفيروسات الكولوبولوس الماوس gp64 تحتوي على صبغة الفلورسنت في 100 ميكرولتر من العازلة حجب لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة في الظلام. بعد غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة، وإعادة تعليق الخلايا الملطخة في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.5 ألبوم مصل البقري. تحليل التعبير gp64 فيروس baculo على الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.عندما تكون الخلايا قابلة للحياة بنسبة 80 إلى 90٪، مع زيادة في القطر، وحصاد الخلايا والتبريد 1 مرات 10 إلى خلايا الطاقة 7 في ملليلتر واحد من الحشرات ثقافة المتوسطة، لتحل محلها مع مصل البقر الجنين 10٪، و 10٪ ديميثيل سلفوإكسيد في حاوية بطيئة التجمد في 80 درجة مئوية سالبة. في اليوم التالي، نقل أنبوب يحتوي على خلايا TIPS إلى ثلاجة النيتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل. الثقافة وتنمو خلايا Sf9 السذاجة في 2 مرات 10 إلى خلية الطاقة 6 لكل ملليلتر في 28 درجة مئوية في عدة قوارير لترين تحتوي على 400 ملليلتر من الخلايا الحشرية ثقافة المتوسطة في حاضنة شاكر التي هي مطلوبة للفيروس المرتبطة أدينو أو إنتاج AAV.بعد ثلاثة إلى أربعة أيام، يتم زيادة كثافة الخلية إلى ما يصل إلى 5 إلى 6 مرات 10 إلى خلايا الطاقة 6 لكل ملليلتر. لإنتاج AAV في قوارير في حاضنة شاكر المدارية، واستخدام ماصة أو مضخة معج للبذور 400 ملليلتر من ثقافة Sf9 في 2 مرات 10 إلى خلايا الطاقة 6 لكل ملليلتر في قارورة سعة لترين، بشكل مطهر. إعداد شاكر المدارية في 125 دورة في الدقيقة و 28 درجة مئوية.تذوب قارورة واحدة من كل خلايا BACULOVIRUS-AAV-GFP وbaculovirus-AAV-rep-cap TIPS. تمييع الخلايا مع 20 ملليلتر من الحشرات المتوسطة الثقافة، وإجراء عدد صلاحية الخلايا باستخدام تريبان الأزرق. تلقيح كل من الخلايا TIPS بنسبة 1 إلى 10،000 بالنسبة للخلايا Sf9 السذاجة المستزرعة في قارورة شاكر أو مفاعل حيوي.في اليوم الثاني، حصاد ملليلتر واحد من ثقافة Sf9 بشكل مطهر، ووصمة عار مع صبغة زرقاء تريبان لتحليل عدد الخلايا، وقابلية البقاء، ومورفولوجيا. في اليوم الثالث، كرر الخطوات التي أجريت في اليوم الثاني، وتحقق من حالة عدوى فيروس الباكولو بعد تلطيخ خلايا SF9. في اليوم الخامس، كرر الخطوات التي أجريت في اليوم الثاني، ومن ثم حصاد ثقافة المتوسطة والخلايا عندما Sf9 البقاء قد انخفض إلى حوالي 50٪ جمع supernatant بيليه الخلية بعد الغزل، وتخزينها في 80 درجة مئوية سالبة.بمجرد إذابة بيليه الخلية المنتجة لل AAV، أضف عازل تحلل الخلية إليها واخلطها بقوة. احتضان بيليه إعادة تعليق لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة للافراج عن جزيئات AAV. بعد الطرد المركزي، قم بنقل الخلية إلى حاوية جديدة.خلط الخلية lysate والثقافة الخلية supernatant بعد ذوبان الجليد. إضافة 20 وحدة لكل نواة ملليلتر وكلوريد المغنيسيوم 10 ملليمولار إلى lysate الخلية لهضم الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، واحتضان لمدة ساعتين إلى أربع ساعات في 37 درجة مئوية. تصفية lysate من خلال 0.8 ميكرومتر و 0.2 ميكرومتر بولي إيثرسولفون نظام الترشيح المزدوج باستخدام مضخة.تخزين lysate الخلية الموضحة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها، أو تنقية AAV على الفور. قم بتركيب عمود AVB Sepharose 10 ملليلتر على جهاز الكروماتوغرافيا، وأدخل خط الأنابيب في عينة AAV، وحاجز الغسيل، وحاجز elution. أدخل أنابيب في فتحات جمع الكسور في آلة الكروماتوغرافيا لجمع كسور من العمود تمرير من خلال الحل، وغسل العازلة، وحاجز elution التي تحتوي على جزيئات AAV.يتوازن عمود AVB Sepharose مع خمسة أحجام عمود من PBS بمعدل تدفق قدره خمسة ملليلترات في الدقيقة. تحميل الخلية المصفاة lysate التي تحتوي على جزيئات AAV على عمود تقارب سيفاروز AVB باستخدام آلة الكروماتوغرافيا مجهزة مضخة عينة. تشغيل العينة بمعدل تدفق من ثلاثة ملليلترات في الدقيقة.تشغيل برنامج تلفزيوني من خلال العمود بمعدل تدفق من ثلاثة ملليلتر في الدقيقة الواحدة حتى منحنى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نانومتر يعود إلى خط الأساس ويصبح مستقرا. Elute جزيئات AAV من العمود سيفاروز AVB مع 50 ملليمولار الصوديوم سيترات العازلة درجة الحموضة 3 بمعدل تدفق من ثلاثة ملليلتر في الدقيقة الواحدة. تمييع فورا AAV supernatant مع حجم خمس 500 ملليمولار تريس HCl pH 8.0 لتحييد العازلة elution الحمضية التي تحتوي على AAV.وهذا يمنع تدهور بواقع الحموضة التي يمكن أن تحدث مع حموضة 3.0 elution العازلة. ثم تمييع TENNATANT AAV عشرة أضعاف مع برنامج تلفزيوني، بحيث جزيئات AAV هي في عازلة الفسيولوجية. تخزين ملليلتر واحد من كل عينة من خلال تشغيل العمود، وغسل العازلة، و 100 ميكرولتر من العملاق AAV eluted لتقييم وجود AAV عن طريق عدوى الخلايا المستهدفة.قم بإعداد نظام ترشيح التدفق العرضي ، المجهز بخرطوشة غشاء البولي إيثرسلفون مع قطع الوزن الجزيئي 100 كيلودالتون لتركيز AAV. تشغيل 200 ملليلتر من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق لتوازن وحدة الترشيح تدفق عرضية. قم بتحميل عينة AAV عن طريق التحكم في تدفق المضخة حتى يتم تقليل العينة إلى الحجم المطلوب.Diafiltrate إعادة مع 100 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. بعد تركيز عينة AAV على الحجم المطلوب ، قم بجمع عينة AAV ، وتصفية من خلال مرشح بولي إيثرسلفون 0.2 ميكرومتر ، وaliquot ذلك. ثم تخزين عينة AAV في 80 درجة مئوية سالبة.أصبحت معظم خلايا Sf9 مصابة بفيروس الباكولو في ثلاثة إلى أربعة أيام ، بسبب جولات متعددة من العدوى ، يتضح من تعبير gp64 glycoprotein فيروس الكولو. معظم الخلايا تظهر أيضا زيادة في القطر. تظهر الخلايا زيادة في القطر ، وتأثير الخلايا ، ويموت حوالي نصف الخلايا في خمسة أيام بعد العدوى ، وهي علامات على الانتهاء من إنتاج AAV.وشوهدت ذروة البروتين في حين elution مع عازلة الحمضية المقابلة لكسر AAV. تظهر عينات AAV المنقى ثلاثة بروتينات capsid متميزة: VP1 و VP2 و VP3 ، بعد SDS-PAGE وتلطيخ الفضة. الخطوة الأكثر أهمية هي حصاد خلايا TIPS قبل حفظ التبريد ، عندما تصاب معظم الخلايا بفيروس الباكولو ، مع الحد الأدنى من عدد وفيات الخلايا.لقد وصفنا إنتاج وتنقية ناقل AAV من النمط المصلي 2 كنموذج هنا. ومع ذلك، يمكن تطبيق البروتوكول على الأنماط المصلية الأخرى AAV أيضا.

Research

JoVE Journal

Biology

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

الطريقة الثقافة القوارض باستخدام الأجنة الجامع للثقافة الدوار زجاجة من نوع النظام

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

مغلق الثقافة خلية بروتوكول النظام باستخدام السفن HYPERStack مع تقنية الغاز مادة نافذ

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

أسلوب الثقافة شريحة لوبعد تطور الجراثيم الأسنان في يزدرع الثقافة

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

و<em&gt; خارج الحي</em&gt; نظام الثقافة لدراسة التنمية الغدة الدرقية

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

الجسم الدهون نظام الثقافة الجهاز في بعوض الزاعجة المصرية، ناقل للفيروس Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

مقايسة دوت كمية وصمة عار لمعايرة إف واستخدامها لتقييم وظيفي للفيروسات المرتبطة بالغدة الجمعية-تفعيل البروتينات

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

الكشف عن الفيروسات والبروتينات اللعابية لناقل نطاط الأوراق في مضيف النبات

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

جيل من الفئران ذات الضربة القاضية الخاصة بالدهون البنية باستخدام نظام Cre-LoxP و CRISPR-Cas9 والفيروس أحادي التوجيه المرتبط بالغدي

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...