Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Vi vil gerne takke Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) for generøst at give os AAV plasmider og Danielle Steele og Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) for deres tekniske bistand. Dette arbejde er støttet af Start-Up fonden fra Cincinnati Children's Research Foundation til M.N.

Se figur 1 for en illustration, der opsummerer protokollen.
1. Generering af baculovirus-inficerede TIPS-celler
<ol><li>Optø et hætteglas af Sf9-celler og frø dem straks i 50 mL insektcellekulturmedie. Knyt Sf9-celler i en orbital shaker inkubator ved 125 omdrejninger og 28 °C i runde bundkolber med løst fastgjort hætte til udveksling af luft8,9. Overfør cellerne i en 1 L kolbe indeholdende 200 mL...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

De parametre, der anvendes i denne protokol til procesudvikling af produktion, rensning og koncentration af AAV-vektorer, kan anvendes til både små og store fremstilling af AAV-vektorer til genterapiapplikationer. Hele opstrøms- og nedstrømsprocessen kan udføres i et lukket system, der er kompatibelt med den aktuelle god fremstillingspraksis (cGMP). De største fordele ved Sf9-baculovirus-systemet er skalerbarhed til storskala AAV-produktion af GMP-kvalitet til en overkommelig pris. Systemet behøver ikke dyre plasm...

Adeno-associerede vira (AAV) er ikke-indhyllede human parvovirus, der indeholder et enkeltstrenget DNA på 4,6 kb. AAV vektorer har flere fordele i forhold til andre virale vektorer til genterapi applikationer1,2,3,4. AAVs er naturligvis replikering-inkompetente, dermed kræver en hjælper virus og vært maskiner til replikation. AAVs forårsager ingen sygdom og har lav immunogenicitet hos den inficerede vært3,5. AAV kan inficere både quiescent og aktivt dividere celler og kan fortsætte som episome uden at integrere i genomet af værtscellerne (AAV sjældent integreres i værtsgenomet)1,3. Disse funktioner har gjort AAV et ønskeligt værktøj til genterapi applikationer.
For at generere en AAV-genoverførselsvektor klones transgenekassetten, herunder det terapeutiske gen, mellem to interne terminalrevationer (ITR'er), som typisk er afledt af AAV-serotype 2. Den maksimale størrelse fra 5' ITR til 3' ITR, inklusive transgenesekvensen, er 4,6 kb6. Forskellige capsider kan have en anden celle eller væv trotropi. Derfor bør capsider vælges ud fra vævs- eller celletypen, der er beregnet til at blive målrettet med AAV-vektoren7.
Rekombinant AAV vektorer er almindeligt produceret i pattedyr cellelinjer såsom menneskelige embryonale nyreceller, HEK293 ved forbigående overførsel af AAV genoverførsel vektor, AAV rep-cap, og hjælper virus plasmider2,3. Der er dog flere begrænsninger for storskala AAV-produktion ved forbigående transfektion af klæbende HEK293-celler. For det første er der brug for et stort antal cellestakke eller rulleflasker. For det andet er der behov for plasmid-DNA- og transfectionreagenser af høj kvalitet, hvilket øger produktionsomkostningerne. Endelig er serumet, når der bruges klæbende HEK293-celler, ofte nødvendigt for optimal produktion, hvilket komplicerer downstream-forarbejdning1,2,3. En alternativ metode til fremstilling af AAV indebærer brug af insektcellelinjen, Spodoptera frugiperda (Sf9) celler og en insektvirus kaldet rekombinant Autographa californica multicapsid nuklear polyhedrosevirus (AcMNPV eller baculovirus)8,9,10. Sf9-celler dyrkes i serumfri suspensionskultur, der er let at skalere op og er kompatibel med den nuværende produktion af god fremstillingspraksis (cGMP) i stor skala, hvilket ikke kræver plasmid- eller transfectionreagenser. Desuden er omkostningerne ved AAV-produktionen ved hjælp af Sf9-baculovirus-systemet lavere end omkostningerne ved at anvende forbigående transfektion af plasmider i HEK293-cellerne11.
Det oprindelige rAAV-produktionssystem ved hjælp af baculovirus-Sf9-celler anvendte tre baculovirus: en baculovirus, der indeholder genoverførselskassette, den anden baculovirus, der indeholder rep-gen, og den tredje baculovirus, der indeholder serotypespecifikt capsid-gen12,13. Baculovirus, der indeholdt rep construct, var imidlertid genetisk ustabil på flere passager, hvilket forhindrede forstærkning af baculovirus til den store AAV-produktion. For at løse dette problem blev der udviklet et nyt rAAV-vektorsystem, som indeholdt to baculovirus (TwoBac): en baculovirus, der indeholder AAV-genoverførselskassetten og en anden baculovirus, der indeholder AAV rep-cap-generne sammen, som er genetisk mere stabile end det oprindelige system og mere bekvemme at producere rAAV på grund af brug af TwoBac i stedet for tre14, 15. OneBac-systemet bruger AAV-genoverførselskassetten og rep-cap-generne i en enkelt baculovirus, som er mere praktisk at producere rAAV på grund af brug af en baculovirus i stedet for at bruge TwoBac eller ThreeBac2,16,17. I vores undersøgelse blev TwoBac-systemet brugt til optimering.
Baculovirussystemet til AAV-produktion har også begrænsninger: baculoviruspartikler er ustabile til langtidsopbevaring i serumfri medium11, og hvis baculovirus titeren er lav, er der behov for en stor mængde baculovirus supernatant, som kan blive giftig for væksten af Sf9-celler under AAV-produktion (personlig observation). Brugen af titer-mindre inficeret celle bevarelse og opskalering (TIPS) celler, eller baculovirus-inficerede insektceller (BIIC), giver en god mulighed for AAV produktion, hvor baculovirus-inficerede Sf9 celler er forberedt, kryopreserveret, og efterfølgende anvendes til infektion af friske Sf9 celler. En anden fordel er den øgede stabilitet af baculovirus (BV) i Sf9-celler efter kryopræservering10,11.
To typer AF TIPS celler er genereret for at muliggøre AAV produktion: den første ved infektion af Sf9 celler med BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen, og den anden ved infektion af Sf9 celle med BV-AAV2-rep-cap. TIPS celler er cryopreserved i små og klar til brug aliquots. AAV vektorer produceres i serum-fri suspension kultur i en kolbe placeret i en orbital shaker eller Wave bioreaktor ved co-dyrkning TIPS celler, der producerer baculovirus og friske Sf9 celler. Sf9 celler er inficeret med baculovirus, der bærer AAV2-GFP vektor og rep-cap sekvenser til at generere AAV. Fire til fem dage senere, når AAV udbytter er de højeste, er producentcellerne lysed med vaskemiddel til at frigive AAV partikler. Cellelyset afklares efterfølgende ved lavhastighedscentrifugering og filtrering. AAV partikler renses fra lysatet ved AVB Sepharose kolonnekromatografi. Endelig er AAV vektorer koncentreret ved hjælp af TFF. Protokollen beskriver produktionen af AAV i lille skala, nyttig til forskning og prækliniske undersøgelser. Metoderne er dog skalerbare og kompatible med fremstilling af AAV-vektorer af klinisk kvalitet til genterapiapplikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

Adeno-associerede vira (AAV) er lovende vektorer for genterapi applikationer. Her produceres AAV2-vektoren af co-kultur af Spodoptera frugiperda (Sf9) celler med Sf9-celler inficeret med baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) og BV-AAV2-rep-cap i serumfri suspensionskultur. Celler dyrkes i en kolbe i en orbital shaker eller Wave bioreaktor. For at frigive AAV-partiklerne lyser producentcellerne i bufferholdigt vaskemiddel, som efterfølgende afklares ved lavhastighedscentrifugering og filtrering. AAV-partikler renses fra cellelyset ved hjælp af AVB Sepharose kolonnekromatografi, som binder AAV-partikler. Bundne partikler vaskes med PBS for at fjerne forurenende stoffer og uddrives fra harpiksen ved hjælp af natriumcitratbuffer ved pH 3.0. Den sure eluat neutraliseres med alkalisk Tris-HCl buffer (pH 8.0), fortyndet med fosfatbuffered saltvand (PBS) og yderligere koncentreret med tangentiel flowfiltrering (TFF). Protokollen beskriver små prækliniske vektor produktion kompatibel med opskalering til storstilet klinisk kvalitet AAV fremstilling for human genterapi applikationer.

Her vises de repræsentative resultater af procesudvikling til produktion og rensning af AAV-vektorer ved hjælp af Sf9-insektcellesystemet. Metoden omfatter samkultur af Sf9-celler med baculovirusinficerede TIPS-celler, fodring af cellerne med vækstmedium, høst og lysis af producentcellerne for at frigive AAV-partiklerne, afklaring af cellelyset med nukleasebehandling, centrifugering og filtrering, rensning af AAV ved hjælp af AVB Sepharose affinitetskromatografi og koncentration med TFF (figur 1...

Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

I denne protokol produceres AAV2 vektor af co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insektceller med baculovirus (BV)-AAV2-grønt fluorescerende protein (GFP) eller terapeutisk gen og BV-AAV2-rep-cap inficerede Sf9-celler i suspension kultur. AAV partikler frigives fra cellerne ved hjælp af vaskemiddel, afklaret, renset ved affinitet kolonne kromatografi, og koncentreret ved tangentiel flow filtrering.

Procesudvikling til produktion og rensning af Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector ved hjælp af Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Denne protokol vil være nyttig for de efterforskere, der ønsker at udvikle metoder til AAV produktion og rensning ved hjælp af baculovirus-insekt celle kultur system. AAV-produktion ved hjælp af baculovirus-insektcellekultursystem er en omkostningseffektiv metode, der er let at skalere op og er kompatibel med den nuværende gode fremstillingspraksis. Nogle dele af protokollen vil blive demonstreret af Alan Heizer, en forskningsassistent i mit laboratorium.Begynd med at optø et hætteglas af Sf9-celler, og frø dem straks i 15 milliliter insektcellekulturmedie. Dyrk Sf9-celler i en orbital shaker inkubator ved 125 RPM og 28 grader Celsius i runde bundkolber med en løst fastgjort hætte til udveksling af luft. Former cellerne i en en-liters kolbe, der indeholder 200 milliliter medium til at opnå nok celler til TIPS celleproduktion.Tilsæt 50 milliliter sf9-celler ved 2 gange 10 til de 6. effektceller pr. milliliter i to kolber. Inficere en kolbe af Sf9 celler med 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-GFP, og den anden kolbe af celler med 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-rep-cap. Tre dage senere, høste en lille aliquot af baculovirus-inficerede Sf9 celler, også kendt som TIPS celler.Plet 2 gange 10 til 5. effekt af både ikke-inficerede og baculovirusinficerede Sf9-celler med 0,5 mikrogram mus anti-baculovirus gp64 antistof, der indeholder et fluorescerende farvestof i 100 mikroliters af blokerende buffer i 30 minutter ved omgivelsestemperatur i mørke. Efter vask af cellerne med PBS for at fjerne antistoffet suspenderes de farvede celler igen i 300 mikroliter PBS, der indeholder 0,5 kvægserumalbumin. Analysere baculovirus gp64 udtryk på celler ved hjælp af flow cytometri.Når cellerne er 80 til 90%levedygtige, med en stigning i diameter, høste cellerne og kryopreserve 1 gange 10 til 7th effektceller i en milliliter insektkultur medium, erstattet med 10% føtalt kvæg serum og 10% dimethyl sulfoxid i en langsomt frysende beholder ved minus 80 grader Celsius. Den næste dag overføres røret, der indeholder TIPS-celler, til en flydende nitrogenfryser til langtidsopbevaring. Kultur og vokse naive Sf9 celler på 2 gange 10 til den 6. power celle per milliliter ved 28 grader Celsius i flere to-liters kolber indeholdende 400 milliliter insekt celle kultur medium i en shaker inkubator, der er nødvendig for adeno-associeret virus eller AAV produktion.Efter tre til fire dage øges celletætheden til op til 5 til 6 gange 10 til 6. effektceller pr. milliliter. Til AAV-produktion i kolber i en orbital shaker inkubator skal du bruge en pipette eller en peristaltisk pumpe til at så 400 milliliter sf9-kultur ved 2 gange 10 til 6. kraftceller pr. milliliter i en to-liters kolbe, aseptisk. Opsætning af orbital shaker ved 125 RPM og 28 grader Celsius.Optø et hætteglas af hver baculovirus-AAV-GFP og baculovirus-AAV-rep-cap TIPS celler. Fortynd cellerne med 20 milliliter insektkulturmedie, og udfør et levedygtighedstal af cellerne ved hjælp af trypanblå. Pod begge TIPS-celler i et forhold på 1 til 10.000 i forhold til de naive Sf9-celler, der dyrkes i en shakerkolbe eller bioreaktor.På dag to, høste en milliliter af Sf9 kultur aseptisk, og plette med trypan blå farvestof til at analysere celletal, levedygtighed, og morfologi. På dag tre gentages de trin, der udføres på dag to, og kontroller status for baculovirusinfektionen efter farvning af Sf9-cellerne. På dag fem gentages de trin, der udføres på den anden dag, og høst derefter kulturmediet og cellerne, når Sf9-levedygtigheden er faldet til omkring 50% Saml supernatanten og cellepillen efter spinding, og opbevar dem ved minus 80 grader Celsius.Når AAV-producent celle pellet er optøet, tilføje celle lysis buffer til det og blandes kraftigt. Inkuber den genophængte pellet i 30 minutter ved omgivelsestemperatur for at frigive AAV-partiklerne. Efter centrifugering overføres cellelyset til en ny beholder.Bland cellelysatet og cellekulturens supernatant efter optøning. Tilsæt 20 enheder pr. milliliternuklease og 10 millimolar magnesiumchlorid til cellelyset for at fordøje DNA og RNA, og inkuber i to til fire timer ved 37 grader Celsius. Lysatet filtreres gennem et 0,8 mikrometer og 0,2 mikrometer polyethersulfon dobbeltfiltreringssystem ved hjælp af en pumpe.Opbevar den afklarede cellelyt ved fire grader Celsius natten over, eller rengør AAV'en med det samme. Monter en 10-milliliter AVB Sepharose kolonne på kromatografimaskinen, og sæt rørledningen i AAV-prøven, vaskebufferen og elutionbufferen. Sæt rør i kromatografimaskinens fraktionsamleråbninger for at opsamle fraktioner af kolonnegennemgangsopløsning, vaskebuffer og elutionsbuffer, der indeholder AAV-partiklerne.Ekvilibrere AVB Sepharose kolonnen med fem kolonne mængder PBS med en strømningshastighed på fem milliliter i minuttet. Læg det filtrerede cellelys, der indeholder AAV-partikler, på AVB Sepharose-affinitetskolonnen ved hjælp af kromatografimaskinen, der er udstyret med en prøvepumpe. Kør prøven med en strømningshastighed på tre milliliter pr. minut.Kør PBS gennem kolonnen med en strømningshastighed på tre milliliter i minuttet, indtil den ultraviolette absorbanskurve ved 280 nanometer vender tilbage til baseline og bliver stabil. Eluter AAV-partiklerne fra AVB Sepharose-kolonnen med 50 millimolar natriumcitratbuffer pH 3 med en strømningshastighed på tre milliliter i minuttet. Fortynd straks AAV supernatanten med et femtedels volumen på 500 millimolar Tris HCl pH 8.0 for at neutralisere den sure elutionsbuffer, der indeholder AAV.Dette forhindrer den pH-medierede nedbrydning, der kan opstå med sur pH 3.0 elutionsbuffer. Fortynd derefter AAV supernatanten tidoblet med PBS, så AAV-partikler er i en fysiologisk buffer. Opbevar en milliliter af hver kolonne gennemløbsprøver, vaskebuffer og 100 mikroliter af den eluted AAV supernatant for at evaluere tilstedeværelsen af AAV ved infektion af målcellerne.Opsætning af tangentiel flow filtreringssystem, udstyret med en polyethersulfone membran patron med en 100-kilodalton molekylvægt cutoff at koncentrere AAV. Kør 200 milliliter PBS i 10 minutter for at ekvilibrere det tangentielle flowfiltreringsmodul. Læg AAV-prøven ved at styre pumpens flow, indtil prøven reduceres til den ønskede lydstyrke.Diafiltrere retentate med 100 milliliter PBS. Når AAV-prøven er koncentreret til det ønskede volumen, opsamles AAV-prøven, den filtreres gennem et 0,2 mikrometer polyethersulfonfilter og aliquoter den. Opbevar derefter AAV-prøven ved minus 80 grader Celsius.De fleste af sf9-cellerne blev inficeret med baculovirus i tre til fire dage, på grund af de mange runder af infektion, fremgår af baculovirus glycoprotein gp64 udtryk. De fleste af cellerne viser også en stigning i diameter. Cellerne viser en stigning i diameter, cytoppatisk effekt, og omkring halvdelen af cellerne dør i fem dage efter infektion, som er tegn på færdiggørelse af AAV produktion.Et højdepunkt af protein blev set, mens elution med en sur buffer svarende til AAV fraktion. De rensede AAV-prøver viser tre forskellige capsidproteiner: VP1, VP2 og VP3 efter SDS-PAGE og sølvfarvning. Det mest kritiske skridt er at høste TIPS-cellerne før kryopræservering, når de fleste celler bliver inficeret med baculovirus, med et minimum antal celledød.Vi har beskrevet produktion og rensning af AAV vektor af serotype 2 som en model her. Protokollen kan dog også anvendes til andre AAV-serotyper.

Research

JoVE Journal

Biology

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Slice Kultur Metode til følgende udvikling i Tand Bakterier In Eksplantat Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur System til Studieinformationen Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Udvikling af en Insert Co-kultur System af to Cellular typer i fravær af celle-celle-Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fedt kroppen organsystem kultur i Aedes Aegypti, en vektor af Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

En kvantitativ Dot skamplet Assay for AAV titrering og dets anvendelse til funktionel vurdering af Adeno-associeret Virus forsamling-aktivering proteiner

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Påvisning af virus- og spytproteiner fra en løvhoppevektor i planteværten

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

Generering af brune fedtspecifikke knockout-mus ved hjælp af et kombineret Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- og adeno-associeret virus-single-guide-RNA-system

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...