Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

We willen Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) bedanken voor het genereus verstrekken van de AAV-plasmiden en Danielle Steele en Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) voor hun technische assistentie. Dit werk wordt ondersteund door het Start-Up fonds van Cincinnati Children's Research Foundation aan M.N.

Zie figuur 1 voor een illustratie van het protocol.
1. Generatie van baculovirus-geïnfecteerde TIPS-cellen
<ol><li>Ontdooi een injectieflacon met Sf9-cellen en zaai ze onmiddellijk in 50 ml insectencelkweekmedium. Kweek Sf9-cellen in een orbitale schuddersubcubator bij 125 tpm en 28 °C in ronde bodemkolven met een losjes bevestigde dop voor luchtuitwisseling8,9. Vermeerder de cellen in een kolf van 1 L...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

De parameters die in dit protocol worden gebruikt voor de procesontwikkeling van productie, zuivering en concentratie van AAV-vectoren kunnen worden toegepast op zowel kleine als grootschalige productie van AAV-vectoren voor gentherapietoepassingen. Het gehele upstream en downstream proces kan worden uitgevoerd in een gesloten systeem dat compatibel is met de huidige Good Manufacturing Practices (cGMP). De grote voordelen van het Sf9-baculovirussysteem zijn schaalbaarheid voor grootschalige GMP-grade AAV-productie tegen ...

Adeno-geassocieerde virussen (AAV) zijn niet-omhulde menselijke parvovirussen die een enkelstrengs DNA van 4,6 kb bevatten. AAV-vectoren hebben verschillende voordelen ten opzichte van andere virale vectoren voor gentherapietoepassingen1,2,3,4. AAV's zijn van nature replicatie-incompetent, waardoor een helpervirus en gastheermachinerie nodig zijn voor replicatie. AAV's veroorzaken geen ziekte en hebben een lage immunogeniciteit in de geïnfecteerde gastheer3,5. AAV kan zowel rustige als actief delende cellen infecteren en kan als episoom blijven bestaan zonder te integreren in het genoom van de gastheercellen (AAV integreert zelden in het gastheergenoom)1,3. Deze kenmerken hebben AAV tot een wenselijk hulpmiddel gemaakt voor gentherapietoepassingen.
Om een AAV-genoverdrachtsvector te genereren, wordt de transgencassette, inclusief het therapeutische gen, gekloond tussen twee interne terminale herhalingen (ITR's), die meestal zijn afgeleid van het AAV-serotype 2. De maximale grootte van 5' ITR tot 3' ITR, inclusief de transgensequentie, is 4,6 kb6. Verschillende capsiden kunnen een ander cel- of weefseltropisme hebben. Daarom moeten capsiden worden gekozen op basis van het weefsel- of celtype dat bedoeld is om te worden gericht met de AAV-vector7.
Recombinante AAV-vectoren worden vaak geproduceerd in zoogdiercellijnen zoals menselijke embryonale niercellen, HEK293 door voorbijgaande transfectie van de AAV-genoverdrachtsvector, AAV rep-cap en helpervirusplasmiden2,3. Er zijn echter verschillende beperkingen voor grootschalige AAV-productie door voorbijgaande transfectie van adherente HEK293-cellen. Ten eerste is een groot aantal celstapels of rolflessen nodig. Ten tweede zijn hoogwaardige plasmide-DNA en transfectiereagentia nodig, wat de productiekosten verhoogt. Ten slotte is het serum bij het gebruik van adherente HEK293-cellen vaak nodig voor een optimale productie, wat de downstream-verwerking1,2,3bemoeilijkt. Een alternatieve methode van AAV-productie omvat het gebruik van de insectencellijn, Spodoptera frugiperda (Sf9) -cellen en een insectenvirus genaamd recombinant Autographa californica multicapsid nucleair polyhedrosevirus (AcMNPV of baculovirus)8,9,10. Sf9-cellen worden gekweekt in serumvrije suspensiecultuur die gemakkelijk op te schalen is en compatibel is met de huidige productie van goede productiepraktijken (cGMP) op grote schaal, waarvoor geen plasmide- of transfectiereagentia nodig zijn. Bovendien zijn de kosten van de AAV-productie met behulp van het Sf9-baculovirussysteem lager dan de kosten van het gebruik van voorbijgaande transfectie van plasmiden in HEK293-cellen11.
Het oorspronkelijke rAAV-productiesysteem met baculovirus-Sf9-cellen gebruikte drie baculovirussen: een baculovirus met genoverdrachtcassette, het tweede baculovirus met rep-gen en het derde baculovirus met serotype-specifiek capsid-gen12,13. Het baculovirus bevattende rep-construct was echter genetisch instabiel bij meerdere passagerondes, wat amplificatie van het baculovirus voor de grootschalige AAV-productie voorkwam. Om dit probleem op te lossen, werd een nieuw rAAV-vectorsysteem ontwikkeld, dat twee baculovirussen (TwoBac) bevatte: een baculovirus met de AAV-genoverdrachtcassette en een ander baculovirus dat de AAV-rep-cap-genen samen bevat die genetisch stabieler zijn dan het oorspronkelijke systeem en handiger om rAAV te produceren vanwege het gebruik van TwoBac in plaats van drie14, 15. Het OneBac-systeem maakt gebruik van de AAV-genoverdrachtcassette en de rep-cap-genen in een enkel baculovirus, wat handiger is om de rAAV te produceren vanwege het gebruik van één baculovirus in plaats van TwoBac of ThreeBac2,16,17. In onze studie werd het TwoBac-systeem gebruikt voor optimalisatie.
Het baculovirussysteem voor AAV-productie heeft ook beperkingen: baculovirusdeeltjes zijn onstabiel voor langdurige opslag in serumvrij medium11, en als de baculovirustiter laag is, is een groot volume baculovirussupernatant nodig, dat giftig kan worden voor de groei van Sf9-cellen tijdens AAV-productie (persoonlijke observatie). Het gebruik van titerloze infected-cell preservation and scale-up (TIPS) cellen, of baculovirus-geïnfecteerde insectencellen (BIIC), biedt een goede optie voor AAV-productie waarbij baculovirus-geïnfecteerde Sf9-cellen worden bereid, gecryopreserveerd en vervolgens gebruikt voor infectie van verse Sf9-cellen. Een ander voordeel is de verhoogde stabiliteit van baculovirus (BV) in Sf9-cellen na cryopreservatie10,11.
Twee soorten TIPS-cellen worden gegenereerd om AAV-productie mogelijk te maken: de eerste door infectie van Sf9-cellen met het BV-AAV2-GFP of therapeutische gen, en de tweede door infectie van Sf9-cel met BV-AAV2-rep-cap. TIPS-cellen worden gecryopreserveerd in kleine en gebruiksklare aliquots. AAV-vectoren worden geproduceerd in serumvrije suspensiecultuur in een kolf die in een orbitale shaker of Wave-bioreactor wordt geplaatst door TIPS-cellen die baculovirussen en verse Sf9-cellen produceren, samen te kweken. Sf9-cellen worden geïnfecteerd door baculovirussen die de AAV2-GFP-vector en de rep-cap-sequenties dragen om AAV te genereren. Vier tot vijf dagen later, wanneer de AAV-opbrengsten het hoogst zijn, worden de productiecellen gelyseerd met wasmiddel om de AAV-deeltjes vrij te geven. Het cellysaat wordt vervolgens geklaard door centrifugeren en filtratie met lage snelheid. AAV-deeltjes worden uit het lysaat gezuiverd door AVB Sepharose-kolomchromatografie. Ten slotte worden AAV-vectoren geconcentreerd met behulp van TFF. Het protocol beschrijft de productie van AAV op kleine schaal, nuttig voor onderzoek en preklinische studies. De methoden zijn echter schaalbaar en compatibel met de productie van klinische AAV-vectoren voor gentherapietoepassingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

Adeno-geassocieerde virussen (AAV) zijn veelbelovende vectoren voor gentherapietoepassingen. Hier wordt de AAV2-vector geproduceerd door co-kweek van Spodoptera frugiperda (Sf9) cellen met Sf9 cellen geïnfecteerd met baculovirus (BV)-AAV2-GFP (of therapeutisch gen) en BV-AAV2-rep-cap in serumvrije suspensiecultuur. Cellen worden gekweekt in een kolf in een orbitale shaker of Wave bioreactor. Om de AAV-deeltjes vrij te maken, worden productiecellen in bufferbevattend reinigingsmiddel gelyseerd, dat vervolgens wordt geklaard door centrifugeren en filtratie met lage snelheid. AAV-deeltjes worden uit het cellysaat gezuiverd met behulp van AVB Sepharose-kolomchromatografie, die AAV-deeltjes bindt. Gebonden deeltjes worden gewassen met PBS om verontreinigingen te verwijderen en geëlueerd uit de hars met behulp van natriumcitraatbuffer bij pH 3,0. Het zure eluaat wordt geneutraliseerd met alkalische Tris-HCl-buffer (pH 8,0), verdund met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en verder geconcentreerd met tangentiële stroomfiltratie (TFF). Het protocol beschrijft kleinschalige preklinische vectorproductie die compatibel is met opschaling naar grootschalige klinische AAV-productie voor menselijke gentherapietoepassingen.

Hier worden de representatieve resultaten van procesontwikkeling voor de productie en zuivering van AAV-vectoren met behulp van het Sf9-insectencelsysteem getoond. De methode omvat co-kweek van Sf9-cellen met baculovirus-geïnfecteerde TIPS-cellen, het voeden van de cellen met groeimedium, het oogsten en lysis van de productiecellen om de AAV-deeltjes vrij te maken, verduidelijking van het cellysaat met nucleasebehandeling, centrifugatie en filtratie, zuivering van AAV met behulp van AVB Sepharose-affiniteitschromatograf...

Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In dit protocol wordt de AAV2-vector geproduceerd door het co-kweken van Spodoptera frugiperda (Sf9) insectencellen met baculovirus (BV)-AAV2-groen fluorescerend eiwit (GFP) of therapeutisch gen en BV-AAV2-rep-cap geïnfecteerde Sf9-cellen in suspensiecultuur. AAV-deeltjes komen vrij uit de cellen met behulp van detergent, worden geklaard, gezuiverd door affiniteitskolomchromatografie en geconcentreerd door tangentiële stromingsfiltratie.

Procesontwikkeling voor de productie en zuivering van Adeno-geassocieerd virus (AAV)2 Vector met behulp van Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Dit protocol zal nuttig zijn voor de onderzoekers die methoden willen ontwikkelen voor AAV-productie en -zuivering met behulp van het baculovirus-insectencelkweeksysteem. AAV-productie met behulp van baculovirus-insectencelkweeksysteem is een kosteneffectieve methode die gemakkelijk op te schalen is en compatibel is met de huidige goede productiepraktijken. Sommige delen van het protocol zullen worden gedemonstreerd door Alan Heizer, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium.Begin met het ontdooien van een flacon Sf9-cellen en zaai ze onmiddellijk in 15 milliliter insectencelkweekmedium. Kweek Sf9-cellen in een orbitale schudderincubator bij 125 RPM en 28 graden Celsius in kolven met ronde bodem met een losjes bevestigde dop voor luchtuitwisseling. Vermeerder de cellen in een kolf van één liter met 200 milliliter medium om voldoende cellen te verkrijgen voor tips-celproductie.Voeg 50 milliliter Sf9-cellen met 2 maal 10 toe aan de 6e powercellen per milliliter in twee kolven. Infecteer een kolf sf9-cellen met 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-GFP en de andere kolf met cellen met 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-rep-cap. Oogst drie dagen later een klein aantal baculovirus-geïnfecteerde Sf9-cellen, ook bekend als TIPS-cellen.Kleur 2 maal 10 tot de 5e macht van zowel niet-geïnfecteerde als baculovirus-geïnfecteerde Sf9-cellen met 0,5 microgram muisantidulovirus gp64-antilichaam met een fluorescerende kleurstof in 100 microliter blokkerende buffer gedurende 30 minuten bij omgevingstemperatuur in het donker. Na het wassen van de cellen met PBS om het antilichaam te verwijderen, suspensies de gekleurde cellen opnieuw in 300 microliter PBS met 0,5 runderserumalbumine. Analyseer de baculovirus gp64-expressie op cellen met behulp van flowcytometrie.Wanneer de cellen 80 tot 90% levensvatbaar zijn, met een toename in diameter, oogst de cellen en cryopreserve 1 maal 10 tot de 7e krachtcellen in één milliliter insectenkweekmedium, verdrongen door 10% foetaal runderserum en 10% dimethylsulfoxide in een langzaam vriescontainer bij negatieve 80 graden Celsius. Breng de volgende dag de buis met TIPS-cellen over naar een vriezer met vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Kweek en kweek naïeve Sf9-cellen met 2 keer 10 tot de 6e power cell per milliliter bij 28 graden Celsius in verschillende kolven van twee liter met 400 milliliter insectencelkweekmedium in een shaker-incubator die nodig is voor adeno-geassocieerd virus of AAV-productie.Na drie tot vier dagen wordt de celdichtheid verhoogd tot maximaal 5 tot 6 keer 10 tot de 6e krachtcellen per milliliter. Gebruik voor AAV-productie in kolven in een orbitale schudderincubator een pipet of een peristaltische pomp om 400 milliliter Sf9-cultuur 2 maal 10 tot de 6e krachtcellen per milliliter aseptisch in een kolf van twee liter te zaaien. Stel de orbitale shaker in op 125 RPM en 28 graden Celsius.Ontdooi één injectieflacon van elke baculovirus-AAV-GFP en baculovirus-AAV-rep-cap TIPS-cellen. Verdun de cellen met 20 milliliter insectenkweekmedium en voer een levensvatbaarheidstelling van de cellen uit met trypan blue. Ent beide TIPS-cellen in een verhouding van 1 tot 10.000 ten opzichte van de naïeve Sf9-cellen die in een shakerkolf of bioreactor zijn gekweekt.Oogst op dag twee aseptisch een milliliter Sf9-cultuur en kleur met de trypanblauwe kleurstof om het celgetal, de levensvatbaarheid en de morfologie te analyseren. Herhaal op dag drie de stappen die op dag twee zijn uitgevoerd en controleer de status van de baculovirusinfectie na het kleuren van de Sf9-cellen. Herhaal op dag vijf de stappen die op de tweede dag zijn uitgevoerd en oogst vervolgens het kweekmedium en de cellen wanneer de levensvatbaarheid van Sf9 is afgenomen tot ongeveer 50%Verzamel het supernatant en de celkorrel na het draaien en bewaar ze bij negatieve 80 graden Celsius.Zodra de AAV-producent celkorrel is ontdooid, voegt u er cellysisbuffer aan toe en mengt u krachtig. Incubeer de opnieuw gesuspendeerde pellet gedurende 30 minuten bij omgevingstemperatuur om de AAV-deeltjes vrij te geven. Breng na centrifugeren het cellysaat over naar een nieuwe container.Meng het cellysaat en celkweek supernatant na het ontdooien. Voeg 20 eenheden per milliliter nuclease en 10-millimolair magnesiumchloride toe aan het cellysaat om het DNA en RNA te verteren en incubaleer gedurende twee tot vier uur bij 37 graden Celsius. Filter het lysaat door een 0,8 micrometer en 0,2 micrometer polyethersulfon dubbelfiltratiesysteem met behulp van een pomp.Bewaar het geklaarde cellysaat 's nachts bij vier graden Celsius of zuiver de AAV onmiddellijk. Monteer een AVB Sepharose-kolom van 10 milliliter op de chromatografiemachine en plaats de pijplijn in het AAV-monster, de wasbuffer en de elutiebuffer. Steek buizen in de fractiecollectorsleuven van de chromatografiemachine om de fracties van de kolomdoorvoeroplossing, wasbuffer en elutiebuffer met de AAV-deeltjes te verzamelen.Breng de AVB Sepharose-kolom in evenwicht met vijf kolomvolumes PBS met een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut. Laad de gefilterde cellysaat met AAV-deeltjes op de AVB Sepharose-affiniteitskolom met behulp van de chromatografiemachine die is uitgerust met een monsterpomp. Voer het monster uit met een stroomsnelheid van drie milliliter per minuut.Voer PBS door de kolom met een stroomsnelheid van drie milliliter per minuut totdat de ultraviolette absorptiecurve op 280 nanometer terugkeert naar de basislijn en stabiel wordt. Eluteer de AAV-deeltjes uit de AVB Sepharose-kolom met 50-millimolaire natriumcitraatbuffer pH 3 bij een stroomsnelheid van drie milliliter per minuut. Verdun het AAV-supernatant onmiddellijk met een volume van een vijfde van 500 millimolaire Tris HCl pH 8,0 om de zure elutiebuffer met AAV te neutraliseren.Dit voorkomt de pH-gemedieerde afbraak die zou kunnen optreden bij zure pH 3.0 elutiebuffer. Verdun vervolgens het AAV-supernatant tienvoudig met PBS, zodat AAV-deeltjes zich in een fysiologische buffer bevinden. Bewaar één milliliter van elke kolomdoorloopmonsters, wasbuffer en 100 microliter van het geëlueerde AAV-supernatant om de aanwezigheid van AAV door infectie van de doelcellen te evalueren.Stel het tangentiële stromingsfiltratiesysteem in, uitgerust met een polyethersulfonmembraanpatroon met een afsnijding van 100 kilodalton om de AAV te concentreren. Laat 200 milliliter PBS gedurende 10 minuten draaien om de tangentiële stromingsfiltratiemodule in evenwicht te brengen. Belast het AAV-monster door het debiet van de pomp te regelen totdat het monster is teruggebracht tot het gewenste volume.Diafiltreer het retentaat met 100 milliliter PBS. Nadat u het AAV-monster tot het gewenste volume hebt geconcentreerd, verzamelt u het AAV-monster, filtert u het door een polyethersulfonfilter van 0,2 micrometer en neemt u het aliquot. Bewaar het AAV-monster vervolgens bij negatieve 80 graden Celsius.De meeste Sf9-cellen raakten binnen drie tot vier dagen geïnfecteerd met het baculovirus, als gevolg van de meerdere infectierondes, aangetoond door baculovirus glycoproteïne gp64-expressie. De meeste cellen vertonen ook een toename in diameter. De cellen vertonen een toename in diameter, cytopathisch effect en ongeveer de helft van de cellen sterft in vijf dagen na infectie, wat de tekenen zijn van voltooiing van de AAV-productie.Een piek van eiwit werd gezien tijdens de elutie met een zure buffer die overeenkomt met de AAV-fractie. De gezuiverde AAV-monsters tonen drie verschillende capsid-eiwitten: VP1, VP2 en VP3, na SDS-PAGE en zilverkleuring. De meest kritieke stap is het oogsten van de TIPS-cellen vóór cryopreservatie, wanneer de meeste cellen geïnfecteerd raken met het baculovirus, met een minimum aantal celdood.We hebben de productie en zuivering van AAV-vector van serotype 2 hier als model beschreven. Het protocol kan echter ook voor andere AAV-serotypen worden toegepast.

Research

JoVE Journal

Biology

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

De Methode van Knaagdieren Hele Embryo Cultuur met behulp van de Rotator-type Bottle Cultuur System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Gesloten systeem Cultuur van de Cel Protocol gebruik HyperStack Schepen met een zuurstofdoorlatende Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

De MultiBac Protein Complex Production Platform in het EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

De Slice kweekmethode voor Na Ontwikkeling van Tooth Germs In explantaatkweek

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Ontwikkeling van een Insert Co-cultuur systeem van twee mobiele soorten in de afwezigheid van cel-cel Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Vet orgel cultuur lichaamssysteem in Aedes Aegypti, een Vector van Zika-Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Een kwantitatieve Dot Blot Assay voor AAV titratie en het gebruik ervan voor functionele beoordeling van het Adeno-associated Virus Assembly-activeren eiwitten

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Het detecteren van virus- en speekseleiwitten van een leafhoppervector in de plantengastheer

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

Generatie van bruine vet-specifieke knock-out muizen met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en Adeno-geassocieerd virus single-guide RNA-systeem

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...