Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Nous tenons à remercier le Dr Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) de nous avoir généreusement fourni les plasmides AAV et Danielle Steele et Rebecca Ernst (Cincinnati Children’s Hospital) pour leur assistance technique. Ce travail est soutenu par le fonds Start-Up de la Cincinnati Children’s Research Foundation à M.N.

Voir la figure 1 pour une illustration résumant le protocole.
1. Génération de cellules TIPS infectées par le baculovirus
<ol><li>Décongeler un flacon de cellules Sf9 et les ensemencer immédiatement dans 50 mL de milieu de culture de cellules d’insectes. Cultiver des cellules Sf9 dans un incubateur à agitateur orbital à 125 tr/min et 28 °C dans des flacons à fond rond avec un bouchon lâchement attaché pour l’échange d’air8</s...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

Les paramètres utilisés dans ce protocole pour le développement de processus de production, de purification et de concentration de vecteurs AAV peuvent être appliqués à la fabrication à petite et à grande échelle de vecteurs AAV pour des applications de thérapie génique. L’ensemble du processus en amont et en aval peut être effectué dans un système fermé compatible avec les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) en vigueur. Les principaux avantages du système Sf9-baculovirus sont l’évolutivité pour l...

Les virus adéno-associés (AAV) sont des parvovirus humains non enveloppés contenant un ADN simple brin de 4,6 kb. Les vecteurs AAV présentent plusieurs avantages par rapport aux autres vecteurs viraux pour les applications de thérapiegénique 1,2,3,4. Les AAV sont naturellement incompétents en matière de réplication, ce qui nécessite un virus auxiliaire et des machines hôtes pour la réplication. Les AAV ne causent aucune maladie et ont une faible immunogénicité chez l’hôte infecté3,5. L’AAV peut infecter à la fois les cellules quiescentes et les cellules en division active et peut persister sous forme d’épisome sans s’intégrer dans le génome des cellules hôtes (l’AAV s’intègre rarement dans le génome de l’hôte)1,3. Ces caractéristiques ont fait de l’AAV un outil souhaitable pour les applications de thérapie génique.
Pour générer un vecteur de transfert de gène AAV, la cassette transgénique, y compris le gène thérapeutique, est clonée entre deux répétitions terminales internes (ITR), qui sont généralement dérivées du sérotype 2 de l’AAV. La taille maximale de 5' ITR à 3' ITR, y compris la séquence transgénique, est de 4,6 kb6. Différentes capsides peuvent avoir un tropisme cellulaire ou tissulaire différent. Par conséquent, les capsides doivent être choisies en fonction du type de tissu ou de cellule destiné à être ciblé avec le vecteur AAV7.
Les vecteurs AAV recombinants sont couramment produits dans des lignées cellulaires de mammifères telles que les cellules rénales embryonnaires humaines, HEK293 par transfection transitoire du vecteur de transfert de gène AAV, AAV rep-cap, et les plasmides du virus auxiliaire2,3. Cependant, il existe plusieurs limitations pour la production d’AAV à grande échelle par transfection transitoire de cellules HEK293 adhérentes. Tout d’abord, un grand nombre de piles de cellules ou de bouteilles à rouleaux sont nécessaires. Deuxièmement, de l’ADN plasmidique de haute qualité et des réactifs de transfection sont nécessaires, ce qui augmente le coût de fabrication. Enfin, lors de l’utilisation de cellules HEK293 adhérentes, le sérum est fréquemment nécessaire pour une production optimale, ce qui complique le traitement en aval1,2,3. Une méthode alternative de fabrication de l’AAV consiste à utiliser la lignée cellulaire d’insectes, les cellules de Spodoptera frugiperda (Sf9) et un virus d’insecte appelé virus de la polyédrose nucléaire multicapside autographa californica recombinant (AcMNPV ou baculovirus)8,9,10. Les cellules Sf9 sont cultivées dans une culture en suspension sans sérum, facile à mettre à l’échelle et compatible avec la production actuelle de bonnes pratiques de fabrication (GMPc) à grande échelle, qui ne nécessite pas de réactifs plasmidiques ou de transfection. De plus, le coût de production de l’AAV à l’aide du système Sf9-baculovirus est inférieur au coût de l’utilisation de la transfection transitoire des plasmides dans les cellules HEK29311.
Le système original de production de rAAV utilisant des cellules baculovirus-Sf9 utilisait trois baculovirus: un baculovirus contenant une cassette de transfert de gènes, le deuxième baculovirus contenant le gène rep et le troisième baculovirus contenant le gène de capside spécifique au sérotype12,13. Cependant, la construction de rep contenant le baculovirus était génétiquement instable sur plusieurs cycles de passages, ce qui a empêché l’amplification du baculovirus pour la production à grande échelle d’AAV. Pour résoudre ce problème, un nouveau système de vecteurs rAAV a été développé, qui contenait deux baculovirus (TwoBac): un baculovirus contenant la cassette de transfert de gène AAV et un autre baculovirus contenant les gènes AAV rep-cap ensemble qui sont génétiquement plus stables que le système original et plus pratiques pour produire rAAV en raison de l’utilisation de TwoBac au lieu de trois14, 15. Le système OneBac utilise la cassette de transfert de gènes AAV et les gènes rep-cap dans un seul baculovirus, ce qui est plus pratique pour produire le rAAV en raison de l’utilisation d’un baculovirus au lieu d’utiliser TwoBac ou ThreeBac2,16,17. Dans notre étude, le système TwoBac a été utilisé pour l’optimisation.
Le système de baculovirus pour la production d’AAV a également des limites: les particules de baculovirus sont instables pour un stockage à long terme dans un milieu sans sérum11, et si le titre de baculovirus est faible, un grand volume de surnageant de baculovirus est nécessaire, ce qui peut devenir toxique pour la croissance des cellules Sf9 pendant la production d’AAV (observation personnelle). L’utilisation de cellules de préservation et de mise à l’échelle des cellules infectées sans titre (TIPS), ou de cellules d’insectes infectées par un baculovirus (BIIC), constitue une bonne option pour la production d’AAV dans laquelle les cellules Sf9 infectées par le baculovirus sont préparées, cryoconservées et ensuite utilisées pour l’infection de cellules Sf9 fraîches. Un autre avantage est la stabilité accrue du baculovirus (BV) dans les cellules Sf9 après cryoconservation10,11.
Deux types de cellules TIPS sont générés pour permettre la production d’AAV: le premier par infection des cellules Sf9 par le gène BV-AAV2-GFP ou thérapeutique, et le second par infection de la cellule Sf9 par BV-AAV2-rep-cap. Les cellules TIPS sont cryoconservées dans de petites aliquotes prêtes à l’emploi. Les vecteurs AAV sont produits en culture en suspension sans sérum dans une fiole placée dans un agitateur orbital ou un bioréacteur Wave en co-cultivant des cellules TIPS qui produisent des baculovirus et des cellules Sf9 fraîches. Les cellules Sf9 sont infectées par des baculovirus porteurs du vecteur AAV2-GFP et des séquences rep-cap pour générer l’AAV. Quatre à cinq jours plus tard, lorsque les rendements en AAV sont les plus élevés, les cellules productrices sont lysées avec du détergent pour libérer les particules d’AAV. Le lysat cellulaire est ensuite clarifié par centrifugation et filtration à basse vitesse. Les particules d’AAV sont purifiées du lysat par chromatographie sur colonne AVB Sepharose. Enfin, les vecteurs AAV sont concentrés à l’aide de TFF. Le protocole décrit la production d’AAV à petite échelle, utile pour la recherche et les études précliniques. Cependant, les méthodes sont évolutives et compatibles avec la fabrication de vecteurs AAV de qualité clinique pour les applications de thérapie génique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs prometteurs pour les applications de thérapie génique. Ici, le vecteur AAV2 est produit par co-culture de cellules Spodoptera frugiperda (Sf9) avec des cellules Sf9 infectées par le baculovirus (BV)-AAV2-GFP (ou gène thérapeutique) et BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension sans sérum. Les cellules sont cultivées dans une fiole dans un agitateur orbital ou un bioréacteur Wave. Pour libérer les particules d’AAV, les cellules productrices sont lysées dans un tampon contenant du détergent, qui est ensuite clarifié par centrifugation et filtration à basse vitesse. Les particules d’AAV sont purifiées du lysat cellulaire à l’aide de la chromatographie sur colonne AVB Sepharose, qui lie les particules d’AAV. Les particules liées sont lavées avec du PBS pour éliminer les contaminants et éluées de la résine à l’aide d’un tampon de citrate de sodium à pH 3,0. L’éluat acide est neutralisé avec un tampon alcalin Tris-HCl (pH 8,0), dilué avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et concentré par filtration à flux tangentiel (TFF). Le protocole décrit la production de vecteurs précliniques à petite échelle compatible avec la fabrication d’AAV de qualité clinique à grande échelle pour les applications de thérapie génique humaine.

Ici, les résultats représentatifs du développement de processus pour la production et la purification de vecteurs AAV à l’aide du système de cellules d’insectes Sf9 sont présentés. La méthode comprend la co-culture de cellules Sf9 avec des cellules TIPS infectées par le baculovirus, l’alimentation des cellules avec un milieu de croissance, la récolte et la lyse des cellules productrices pour libérer les particules aAV, la clarification du lysat cellulaire avec un traitement nucléase, la centrifugation e...

Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Dans ce protocole, le vecteur AAV2 est produit en co-cultivant des cellules d’insectes Spodoptera frugiperda (Sf9) avec la protéine fluorescente verte (GFP) baculovirus (BV)-AAV2 ou un gène thérapeutique et des cellules Sf9 infectées par BV-AAV2-rep-cap en culture de suspension. Les particules d’AAV sont libérées des cellules à l’aide d’un détergent, clarifiées, purifiées par chromatographie sur colonne d’affinité et concentrées par filtration à flux tangentiel.

Développement de procédés pour la production et la purification du vecteur du virus adéno-associé (AAV)2 à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insecte

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Ce protocole sera utile pour les chercheurs qui souhaitent développer des méthodes de production et de purification de l’AAV à l’aide du système de culture cellulaire baculovirus-insectes. La production d’AAV à l’aide d’un système de culture cellulaire baculovirus-insectes est une méthode rentable, facile à mettre à l’échelle et compatible avec les bonnes pratiques de fabrication actuelles. Certaines parties du protocole seront démontrées par Alan Heizer, un assistant de recherche de mon laboratoire.Commencez par décongeler un flacon de cellules Sf9 et ensemencez-les immédiatement dans 15 millilitres de milieu de culture de cellules d’insectes. Cultivez des cellules Sf9 dans un incubateur à agitateur orbital à 125 tr / min et 28 degrés Celsius dans des flacons à fond rond avec un capuchon lâche pour l’échange d’air. Propager les cellules dans une fiole d’un litre contenant 200 millilitres de milieu pour obtenir suffisamment de cellules pour la production de cellules TIPS.Ajouter 50 millilitres de cellules Sf9 à 2 fois 10 aux 6ème cellules de puissance par millilitre dans deux flacons. Infecter une fiole de cellules Sf9 avec 0,5 millilitre de baculovirus-AAV2-GFP, et l’autre fiole de cellules avec 0,5 millilitre de baculovirus-AAV2-rep-capuchon. Trois jours plus tard, récoltez une petite aliquote de cellules Sf9 infectées par le baculovirus, également connues sous le nom de cellules TIPS.Colorez 2 fois 10 à la 5ème puissance des cellules Sf9 non infectées et infectées par le baculovirus avec 0,5 microgramme d’anticorps anti-baculovirus gp64 de souris contenant un colorant fluorescent dans 100 microlitres de tampon bloquant pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après avoir lavé les cellules avec du PBS pour éliminer l’anticorps, remettez en suspension les cellules colorées dans 300 microlitres de PBS contenant 0,5 albumine sérique bovine. Analyser l’expression du baculovirus gp64 sur les cellules à l’aide de la cytométrie en flux.Lorsque les cellules sont viables à 80 à 90%, avec une augmentation du diamètre, récoltez les cellules et cryoconservez 1 fois 10 à la 7ème puissance des cellules dans un millilitre de milieu de culture d’insectes, supplanté par 10% de sérum bovin fœtal et 10% de diméthylsulfoxyde dans un récipient à congélation lente à 80 degrés Celsius négatifs. Le lendemain, transférez le tube contenant des cellules TIPS dans un congélateur à azote liquide pour un stockage à long terme. Cultiver et cultiver des cellules Sf9 naïves à 2 fois 10 à la 6ème cellule de puissance par millilitre à 28 degrés Celsius dans plusieurs flacons de deux litres contenant 400 millilitres de milieu de culture cellulaire d’insectes dans un incubateur shaker nécessaire à la production de virus adéno-associé ou d’AAV.Après trois à quatre jours, la densité cellulaire est augmentée jusqu’à 5 à 6 fois 10 à la 6ème puissance des cellules par millilitre. Pour la production d’AAV dans des flacons dans un incubateur à agitateur orbital, utilisez une pipette ou une pompe péristaltique pour ensemencer 400 millilitres de culture Sf9 à 2 fois 10 à la 6ème pile de puissance par millilitre dans une fiole de deux litres, de manière aseptique. Installez le secoueur orbital à 125 tr / min et 28 degrés Celsius.Décongeler un flacon de chaque cellule TIPS baculovirus-AAV-GFP et baculovirus-AAV-rep-capuchon. Diluer les cellules avec 20 millilitres de milieu de culture d’insectes et effectuer un comptage de viabilité des cellules à l’aide de bleu de trypan. Inoculer les deux cellules TIPS dans un rapport de 1 à 10 000 par rapport aux cellules Naïves Sf9 cultivées dans une fiole agitatrice ou un bioréacteur.Le deuxième jour, récoltez un millilitre de culture Sf9 de manière aseptique et colorez avec le colorant bleu trypan pour analyser le nombre de cellules, la viabilité et la morphologie. Le troisième jour, répétez les étapes effectuées le deuxième jour et vérifiez l’état de l’infection à baculovirus après avoir coloré les cellules Sf9. Le cinquième jour, répétez les étapes effectuées le deuxième jour, puis récoltez le milieu de culture et les cellules lorsque la viabilité de Sf9 a diminué à environ 50% Collectez le surnageant et la pastille cellulaire après la filature, et stockez-les à 80 degrés Celsius négatifs.Une fois que la pastille de cellule productrice d’AAV est décongelée, ajoutez-y un tampon de lyse cellulaire et mélangez vigoureusement. Incuber la pastille en suspension pendant 30 minutes à température ambiante pour libérer les particules AAV. Après centrifugation, transférer le lysat cellulaire dans un nouveau récipient.Mélanger le lysat cellulaire et le surnageant de culture cellulaire après décongélation. Ajouter 20 unités par millilitre de nucléase et du chlorure de magnésium de 10 millimolaires au lysat cellulaire pour digérer l’ADN et l’ARN, et incuber pendant deux à quatre heures à 37 degrés Celsius. Filtrer le lysat à travers un système de double filtration en polyéthersulfone de 0,8 micromètre et 0,2 micromètre à l’aide d’une pompe.Conservez le lysat de cellules clarifié à quatre degrés Celsius pendant la nuit ou purifiez immédiatement l’AAV. Montez une colonne AVB Sepharose de 10 millilitres sur la machine de chromatographie et insérez le tuyau dans l’échantillon AAV, le tampon de lavage et le tampon d’élution. Insérez des tubes dans les fentes du collecteur de fractions de la machine de chromatographie pour recueillir les fractions de la solution de passage de colonne, du tampon de lavage et du tampon d’élution contenant les particules AAV.Équilibrez la colonne AVB Sepharose avec cinq volumes de colonne de PBS à un débit de cinq millilitres par minute. Chargez le lysat de cellule filtré contenant des particules AAV sur la colonne d’affinité AVB Sepharose à l’aide de la machine de chromatographie équipée d’une pompe à échantillon. Exécutez l’échantillon à un débit de trois millilitres par minute.Faites passer le PBS à travers la colonne à un débit de trois millilitres par minute jusqu’à ce que la courbe d’absorbance ultraviolette à 280 nanomètres revienne à la ligne de base et devienne stable. Éluez les particules d’AAV de la colonne AVB Sepharose avec un tampon de citrate de sodium de 50 millimolaires pH 3 à un débit de trois millilitres par minute. Diluer immédiatement le surnageant AAV avec un volume d’un cinquième de Tris HCl pH 8,0 de 500 millimolaires pour neutraliser le tampon d’élution acide contenant de l’AAV.Cela empêche la dégradation médiée par le pH qui pourrait se produire avec un tampon d’élution acide pH 3.0. Ensuite, diluez dix fois le surnageant AAV avec du PBS, de sorte que les particules d’AAV soient dans un tampon physiologique. Conservez un millilitre d’échantillons traversant chaque colonne, un tampon de lavage et 100 microlitres du surnageant AAV élué pour évaluer la présence d’AAV par infection des cellules cibles.Installez le système de filtration à flux tangentiel, équipé d’une cartouche à membrane de polyéthersulfone avec une coupure de poids moléculaire de 100 kilodaltons pour concentrer l’AAV. Exécutez 200 millilitres de PBS pendant 10 minutes pour équilibrer le module de filtration à flux tangentiel. Chargez l’échantillon AAV en contrôlant le débit de la pompe jusqu’à ce que l’échantillon soit réduit au volume souhaité.Diafiltrer le rétentat avec 100 millilitres de PBS. Après avoir concentré l’échantillon d’AAV au volume souhaité, prélevez l’échantillon d’AAV, filtrez-le à travers un filtre en polyéthersulfone de 0,2 micromètre et aliquotez-le. Conservez ensuite l’échantillon d’AAV à 80 degrés Celsius négatifs.La plupart des cellules Sf9 ont été infectées par le baculovirus en trois à quatre jours, en raison des multiples cycles d’infection, mis en évidence par l’expression de la glycoprotéine gp64 du baculovirus. La plupart des cellules montrent également une augmentation du diamètre. Les cellules montrent une augmentation du diamètre, un effet cytopathique, et environ la moitié des cellules meurent dans les cinq jours suivant l’infection, qui sont les signes de l’achèvement de la production d’AAV.Un pic de protéines a été observé lors de l’élution avec un tampon acide correspondant à la fraction AAV. Les échantillons d’AAV purifiés montrent trois protéines de capside distinctes: VP1, VP2 et VP3, après SDS-PAGE et coloration à l’argent. L’étape la plus critique consiste à prélever les cellules TIPS avant la cryoconservation, lorsque la plupart des cellules sont infectées par le baculovirus, avec un nombre minimum de morts cellulaires.Nous avons décrit la production et la purification du vecteur AAV du sérotype 2 comme modèle ici. Cependant, le protocole peut également être appliqué à d’autres sérotypes AAV.

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Biology

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