Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Wir danken Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) für die großzügige Bereitstellung der AAV-Plasmide und Danielle Steele und Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wird durch den Start-Up-Fonds der Cincinnati Children's Research Foundation an M.N.

In Abbildung 1 finden Sie eine Abbildung, die das Protokoll zusammenfasst.
1. Erzeugung von Baculovirus-infizierten TIPS-Zellen
<ol><li>Tauen Sie eine Durchstechflasche mit Sf9-Zellen auf und säen Sie sie sofort in 50 ml Insektenzellkulturmedium. Es werden Sf9-Zellen in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 125 U/min und 28 °C in Rundkolben mit einer lose angebrachten Kappe zum Luftaustausch8,9 gezüchtet.</sup...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

Die Parameter, die in diesem Protokoll für die Prozessentwicklung der Produktion, Reinigung und Konzentration von AAV-Vektoren verwendet werden, können sowohl auf die Herstellung von AAV-Vektoren im kleinen als auch auf den großen Maßstab für Gentherapieanwendungen angewendet werden. Der gesamte vor- und nachgelagerte Prozess kann in einem geschlossenen System durchgeführt werden, das mit den aktuellen Good Manufacturing Practices (cGMP) kompatibel ist. Die Hauptvorteile des Sf9-Baculovirus-Systems sind die Skalier...

Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind unbehüllte humane Parvoviren, die eine einzelsträngige DNA von 4,6 kb enthalten. AAV-Vektoren haben mehrere Vorteile gegenüber anderen viralen Vektoren für Gentherapieanwendungen1,2,3,4. AAVs sind von Natur aus replikationsinkompetent und benötigen daher einen Hilfsvirus und eine Host-Maschinerie für die Replikation. AAVs verursachen keine Krankheit und haben eine geringe Immunogenität im infizierten Wirt3,5. AAV kann sowohl ruhende als auch sich aktiv teilende Zellen infizieren und kann als Episom bestehen bleiben, ohne sich in das Genom der Wirtszellen zu integrieren (AAV integriert sich selten in das Wirtsgenom)1,3. Diese Eigenschaften haben AAV zu einem wünschenswerten Werkzeug für Gentherapieanwendungen gemacht.
Um einen AAV-Gentransfervektor zu erzeugen, wird die Transgenkassette einschließlich des therapeutischen Gens zwischen zwei internen terminalen Wiederholungen (ITRs) kloniert, die typischerweise vom AAV-Serotyp 2 abgeleitet sind. Die maximale Größe von 5' ITR bis 3' ITR, einschließlich der Transgensequenz, beträgt 4,6 kb6. Verschiedene Kapside können einen unterschiedlichen Zell- oder Gewebetropismus haben. Daher sollten Kapside basierend auf dem Gewebe oder Zelltyp ausgewählt werden, der mit demAAV-Vektor 7anvisiert werden soll.
Rekombinante AAV-Vektoren werden üblicherweise in Säugetierzelllinien wie humanen embryonalen Nierenzellen, HEK293 durch vorübergehende Transfektion des AAV-Gentransfervektors, AAV-Rep-Cap und Helfervirusplasmiden2,3produziert. Es gibt jedoch mehrere Einschränkungen für die großflächige AAV-Produktion durch transiente Transfektion von adhärenten HEK293-Zellen. Zunächst wird eine große Anzahl von Zellstapeln oder Rollflaschen benötigt. Zweitens werden hochwertige Plasmid-DNA und Transfektionsreagenzien benötigt, was die Herstellungskosten erhöht. Schließlich wird bei der Verwendung von adhärenten HEK293-Zellen das Serum häufig für eine optimale Produktion benötigt, was die nachgelagerte Verarbeitungerschwert 1,2,3. Eine alternative Methode der AAV-Herstellung beinhaltet die Verwendung der Insektenzelllinie, Spodoptera frugiperda (Sf9) -Zellen und eines Insektenvirus namens rekombinantes Autographa californica Multicapsid-Kernpolyedrosevirus (AcMNPV oder Baculovirus)8,9,10. Sf9-Zellen werden in serumfreier Suspensionskultur gezüchtet, die leicht zu skalieren ist und mit der aktuellen cGMP-Produktion (Good Manufacturing Practice) in großem Maßstab kompatibel ist, die keine Plasmid- oder Transfektionsreagenzien erfordert. Darüber hinaus sind die Kosten für die AAV-Produktion unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Systems niedriger als die Kosten für die vorübergehende Transfektion von Plasmiden in HEK293-Zellen11.
Das ursprüngliche rAAV-Produktionssystem unter Verwendung von Baculovirus-Sf9-Zellen verwendete drei Baculoviren: eine Baculovirus-haltige Gentransferkassette, das zweite Baculovirus-haltiges Rep-Gen und das dritte Baculovirus, das Serotyp-spezifisches Kapsid-Gen12,13. Das Baculovirus-haltige Rep-Konstrukt war jedoch bei mehreren Passagengängen genetisch instabil, was eine Amplifikation des Baculovirus für die großflächige AAV-Produktion verhinderte. Um dieses Problem zu lösen, wurde ein neuartiges rAAV-Vektorsystem entwickelt, das zwei Baculoviren (TwoBac) enthielt: ein Baculovirus, das die AAV-Gentransferkassette enthielt, und ein anderes Baculovirus, das die AAV-Rep-Cap-Gene zusammen enthält, die genetisch stabiler sind als das ursprüngliche System und bequemer zu produzieren rAAV, da TwoBac anstelle von drei14verwendet wird. 15. Das OneBac-System verwendet die AAV-Gentransferkassette und die Rep-Cap-Gene in einem einzigen Baculovirus, das aufgrund der Verwendung eines Baculovirus anstelle von TwoBac oder ThreeBac 2,16 ,17bequemerist,um das rAAV herzustellen. In unserer Studie wurde das TwoBac-System zur Optimierung eingesetzt.
Das Baculovirus-System für die AAV-Produktion hat auch Einschränkungen: Baculovirus-Partikel sind instabil für die Langzeitlagerung in serumfreiem Medium11, und wenn der Baculovirus-Titer niedrig ist, wird eine große Menge an Baculovirus-Überstand benötigt, der für das Wachstum von Sf9-Zellen während der AAV-Produktion toxisch werden kann (persönliche Beobachtung). Die Verwendung von TITERLOSEN INFIZIERTEN ZELLKONSERVIERUNGS- UND SCALE-UP-ZELLEN (TIPS) oder Baculovirus-infizierten Insektenzellen (BIIC) bietet eine gute Option für die AAV-Produktion, bei der Baculovirus-infizierte Sf9-Zellen vorbereitet, kryokonserviert und anschließend für die Infektion von frischen Sf9-Zellen verwendet werden. Ein weiterer Vorteil ist die erhöhte Stabilität des Baculovirus (BV) in Sf9-Zellen nach Kryokonservierung10,11.
Zwei Arten von TIPS-Zellen werden erzeugt, um die AAV-Produktion zu ermöglichen: die erste durch Infektion von Sf9-Zellen mit dem BV-AAV2-GFP oder therapeutischen Gen und die zweite durch Infektion von Sf9-Zellen mit BV-AAV2-rep-cap. TIPS-Zellen werden in kleinen und gebrauchsfertigen Aliquots kryokonserviert. AAV-Vektoren werden in serumfreier Suspensionskultur in einem Kolben hergestellt, der in einem Orbitalschüttler oder Wave-Bioreaktor platziert wird, indem TIPS-Zellen, die Baculoviren und frische Sf9-Zellen produzieren, mitkulturiert werden. Sf9-Zellen sind mit Baculoviren infiziert, die den AAV2-GFP-Vektor und die Rep-Cap-Sequenzen tragen, um AAV zu erzeugen. Vier bis fünf Tage später, wenn die AAV-Ausbeute am höchsten ist, werden die Produzentenzellen mit Reinigungsmittel lysiert, um die AAV-Partikel freizusetzen. Das Zelllysat wird anschließend durch Zentrifugation und Filtration mit niedriger Geschwindigkeit geklärt. AAV-Partikel werden durch AVB-Sepharose-Säulenchromatographie aus dem Lysat gereinigt. Schließlich werden AAV-Vektoren mit TFF konzentriert. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von AAV in kleinem Maßstab, nützlich für Forschung und präklinische Studien. Die Methoden sind jedoch skalierbar und kompatibel mit der Herstellung klinischer AAV-Vektoren für Gentherapieanwendungen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind vielversprechende Vektoren für gentherapeutische Anwendungen. Hier wird der AAV2-Vektor durch Kokultur von Spodoptera frugiperda (Sf9)-Zellen mit Sf9-Zellen hergestellt, die mit Baculovirus (BV)-AAV2-GFP (oder therapeutischem Gen) und BV-AAV2-rep-cap in serumfreier Suspensionskultur infiziert sind. Zellen werden in einem Kolben in einem Orbitalschüttler oder Wave-Bioreaktor kultiviert. Um die AAV-Partikel freizusetzen, werden die Produzentenzellen in einen reinigungsmittelhaltigen Puffer lysiert, der anschließend durch Zentrifugation und Filtration mit niedriger Geschwindigkeit geklärt wird. AAV-Partikel werden aus dem Zelllysat mit hilfe der AVB Sepharose-Säulenchromatographie gereinigt, die AAV-Partikel bindet. Gebundene Partikel werden mit PBS gewaschen, um Verunreinigungen zu entfernen, und mit Natriumcitratpuffer bei pH 3,0 aus dem Harz eluiert. Das saure Eluat wird mit alkalischem Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) neutralisiert, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt und mit tangentialer Strömungsfiltration (TFF) weiter konzentriert. Das Protokoll beschreibt die kleinmaßstäbliche präklinische Vektorproduktion, die mit der Scale-up- bis zur groß angelegten AAV-Herstellung in klinischer Qualität für humane Gentherapieanwendungen kompatibel ist.

Hier werden die repräsentativen Ergebnisse der Prozessentwicklung zur Herstellung und Aufreinigung von AAV-Vektoren unter Verwendung des Sf9-Insektenzellsystems gezeigt. Die Methode umfasst die Kokultur von Sf9-Zellen mit Baculovirus-infizierten TIPS-Zellen, die Fütterung der Zellen mit Wachstumsmedium, die Ernte und Lyse der Produzentenzellen zur Freisetzung der AAV-Partikel, die Klärung des Zelllysats mit Nukleasebehandlung, Zentrifugation und Filtration, die Reinigung von AAV mittels AVB-Sepharose-Affinitätschroma...

Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In diesem Protokoll wird der AAV2-Vektor durch Co-Kultivierung von Spodoptera frugiperda (Sf9) Insektenzellen mit Baculovirus (BV)-AAV2-grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder therapeutischem Gen und BV-AAV2-rep-cap infizierten Sf9-Zellen in Suspensionskultur hergestellt. AAV-Partikel werden mittels Reinigungsmittel aus den Zellen freigesetzt, geklärt, durch Affinitätssäulenchromatographie gereinigt und durch tangentiale Strömungsfiltration konzentriert.

Prozessentwicklung zur Herstellung und Reinigung von Adeno-assoziiertem Virus (AAV)2 Vektor mit Baculovirus-Insekten-Zellkultursystem

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Dieses Protokoll wird für die Forscher nützlich sein, die Methoden für die AAV-Produktion und -Reinigung unter Verwendung des Baculovirus-Insekten-Zellkultursystems entwickeln möchten. Die AAV-Produktion mit Baculovirus-Insekten-Zellkultursystem ist eine kostengünstige Methode, die einfach zu skalieren ist und mit der aktuellen guten Herstellungspraxis kompatibel ist. Einige Teile des Protokolls werden von Alan Heizer, einem Forschungsassistenten meines Labors, demonstriert.Beginnen Sie mit dem Auftauen einer Durchstechflasche mit Sf9-Zellen und säen Sie sie sofort in 15 Milliliter Insektenzellkulturmedium. Züchten Sie Sf9-Zellen in einem Orbital-Shaker-Inkubator bei 125 U / min und 28 Grad Celsius in Rundkolben mit einer lose angebrachten Kappe für den Luftaustausch. Vermehren Sie die Zellen in einem Ein-Liter-Kolben mit 200 Millilitern Medium, um genügend Zellen für die TIPS-Zellproduktion zu erhalten.50 Milliliter Sf9-Zellen mit 2 mal 10 zu den 6. Leistungszellen pro Milliliter in zwei Kolben geben. Infizieren Sie einen Kolben Sf9-Zellen mit 0,5 Millilitern Baculovirus-AAV2-GFP und den anderen Zellkolben mit 0,5 Millilitern Baculovirus-AAV2-rep-cap. Drei Tage später ernten Sie ein kleines Aliquot baculovirus-infizierter Sf9-Zellen, auch bekannt als TIPS-Zellen.Färben Sie 2 mal 10 bis zur 5. Potenz sowohl von nicht infizierten als auch von Baculovirus-infizierten Sf9-Zellen mit 0,5 Mikrogramm Maus-Anti-Baculovirus-gp64-Antikörper, der einen fluoreszierenden Farbstoff in 100 Mikrolitern Blockierungspuffer enthält, für 30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, um den Antikörper zu entfernen, suspendieren Sie die gefärbten Zellen in 300 Mikrolitern PBS, die 0,5 Rinderserumalbumin enthalten. Analysieren Sie die Baculovirus gp64-Expression auf Zellen mithilfe der Durchflusszytometrie.Wenn die Zellen 80 bis 90% lebensfähig sind, mit einer Zunahme des Durchmessers, ernten Sie die Zellen und kryminieren Sie 1 mal 10 bis zur 7. Potenzzelle in einem Milliliter Insektenkulturmedium, ersetzt mit 10% fötalem Rinderserum und 10% Dimethylsulfoxid in einem langsam gefrierenden Behälter bei minus 80 Grad Celsius. Am nächsten Tag das Röhrchen mit TIPS-Zellen zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstoff-Gefrierschrank geben. Kultivieren und züchten Sie naive Sf9-Zellen mit 2 mal 10 bis zur 6. Leistungszelle pro Milliliter bei 28 Grad Celsius in mehreren Zwei-Liter-Kolben mit 400 Millilitern Insektenzellkulturmedium in einem Shaker-Inkubator, der für die Adeno-assoziierte Virus- oder AAV-Produktion benötigt wird.Nach drei bis vier Tagen wird die Zelldichte auf bis zu 5 bis 6 mal 10 bis 6. Leistungszellen pro Milliliter erhöht. Für die AAV-Produktion in Kolben in einem Orbital-Shaker-Inkubator verwenden Sie eine Pipette oder eine Peristaltikpumpe, um 400 Milliliter Sf9-Kultur bei 2 mal 10 bis 6. Leistungszellen pro Milliliter aseptisch in einen Zweiliterkolben zu säen. Stellen Sie den Orbital-Shaker bei 125 U / min und 28 Grad Celsius auf.Tauen Sie eine Durchstechflasche mit jeder Baculovirus-AAV-GFP- und Baculovirus-AAV-Rep-Cap-TIPS-Zelle auf. Verdünnen Sie die Zellen mit 20 Millilitern Insektenkulturmedium und führen Sie eine Lebensfähigkeitszählung der Zellen mit Trypanblau durch. Impfen Sie beide TIPS-Zellen in einem Verhältnis von 1 zu 10.000 relativ zu den naiven Sf9-Zellen, die in einem Schüttelkolben oder Bioreaktor kultiviert wurden.Am zweiten Tag ernten Sie einen Milliliter Sf9-Kultur aseptisch und färben Sie ihn mit dem trypanblauen Farbstoff, um die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Morphologie zu analysieren. Wiederholen Sie am dritten Tag die am zweiten Tag ausgeführten Schritte und überprüfen Sie den Status der Baculovirus-Infektion nach dem Färben der Sf9-Zellen. Wiederholen Sie am fünften Tag die am zweiten Tag ausgeführten Schritte und ernten Sie dann das Kulturmedium und die Zellen, wenn die Lebensfähigkeit von Sf9 auf etwa 50% gesunken ist Sammeln Sie den Überstand und das Zellpellet nach dem Spinnen und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.Sobald das AAV-Produzentenzellpellet aufgetaut ist, fügen Sie ihm Zelllysepuffer hinzu und mischen Sie kräftig. Inkubieren Sie das wieder suspendierte Pellet für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur, um die AAV-Partikel freizusetzen. Nach der Zentrifugation das Zelllysat in einen neuen Behälter überführen.Mischen Sie das Zelllysat und den Zellkulturüberstand nach dem Auftauen. Fügen Sie dem Zelllysat 20 Einheiten pro Milliliter-Nuklease und 10-millimolares Magnesiumchlorid hinzu, um die DNA und RNA zu verdauen, und inkubieren Sie zwei bis vier Stunden bei 37 Grad Celsius. Filtern Sie das Lysat durch ein 0,8 Mikrometer und 0,2 Mikrometer Polyethersulfon Dual-Filtrationssystem mit einer Pumpe.Lagern Sie das geklärte Zelllysat über Nacht bei vier Grad Celsius oder reinigen Sie das AAV sofort. Montieren Sie eine 10-Milliliter-AVB-Sepharose-Säule auf der Chromatographiemaschine und führen Sie die Rohrleitung in die AAV-Probe, den Waschpuffer und den Elutionspuffer ein. Führen Sie Röhrchen in die Fraktionssammlerschlitze der Chromatographiemaschine ein, um die Fraktionen der Säulendurchlauflösung, des Waschpuffers und des Elutionspuffers, die die AAV-Partikel enthalten, zu sammeln.Setzen Sie die AVB Sepharose-Säule mit fünf Säulenvolumina PBS bei einer Durchflussrate von fünf Millilitern pro Minute aus. Laden Sie das gefilterte Zelllysat enthaltende AAV-Partikel mit hilfe der mit einer Probenpumpe ausgestatteten Chromatographiemaschine auf die AVB Sepharose-Affinitätssäule. Führen Sie die Probe mit einer Durchflussrate von drei Millilitern pro Minute aus.Führen Sie PBS mit einer Durchflussrate von drei Millilitern pro Minute durch die Säule, bis die ultraviolette Absorptionskurve bei 280 Nanometern zur Grundlinie zurückkehrt und stabil wird. Eluieren Sie die AAV-Partikel aus der AVB Sepharose-Säule mit einem 50-Millimolar-Natriumcitrat-Puffer pH 3 bei einer Durchflussrate von drei Millilitern pro Minute. Verdünnen Sie den AAV-Überstand sofort mit einem Fünftel Volumen von 500 Millimolar Tris HCl pH 8,0, um den sauren Elutionspuffer, der AAV enthält, zu neutralisieren.Dies verhindert den pH-vermittelten Abbau, der bei saurem pH-3,0-Elutionspuffer auftreten könnte. Dann verdünnen Sie den AAV-Überstand zehnfach mit PBS, so dass sich AAV-Partikel in einem physiologischen Puffer befinden. Lagern Sie einen Milliliter jeder Säulendurchlaufproben, einen Waschpuffer und 100 Mikroliter des eluierten AAV-Überstands, um das Vorhandensein von AAV durch Infektion der Zielzellen zu bewerten.Richten Sie das tangentiale Strömungsfiltrationssystem ein, das mit einer Polyethersulfon-Membrankartusche mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 100 Kilodalton ausgestattet ist, um den AAV zu konzentrieren. Führen Sie 200 Milliliter PBS für 10 Minuten aus, um das tangentiale Durchflussfiltrationsmodul auszugleichen. Laden Sie die AAV-Probe, indem Sie den Durchfluss der Pumpe steuern, bis die Probe auf das gewünschte Volumen reduziert ist.Diafiltrieren Sie das Retentat mit 100 Milliliter PBS. Nachdem Sie die AAV-Probe auf das gewünschte Volumen konzentriert haben, sammeln Sie die AAV-Probe, filtern Sie sie durch einen 0,2 Mikrometer Polyethersulfonfilter und aliquotieren Sie sie. Anschließend lagern Sie die AAV-Probe bei minus 80 Grad Celsius.Die meisten Sf9-Zellen infizierten sich innerhalb von drei bis vier Tagen mit dem Baculovirus, aufgrund der mehreren Infektionsrunden, die durch die Expression des Baculovirus-Glykoproteins gp64 belegt wurden. Die meisten Zellen zeigen auch eine Zunahme des Durchmessers. Die Zellen zeigen eine Zunahme des Durchmessers, eine zytopathische Wirkung, und etwa die Hälfte der Zellen stirbt fünf Tage nach der Infektion ab, was die Zeichen für den Abschluss der AAV-Produktion ist.Ein Proteinpeak wurde bei der Elution mit einem sauren Puffer beobachtet, der der AAV-Fraktion entspricht. Die gereinigten AAV-Proben zeigen drei verschiedene Kapsidproteine: VP1, VP2 und VP3, nach SDS-PAGE und Silberfärbung. Der kritischste Schritt ist die Ernte der TIPS-Zellen vor der Kryokonservierung, wenn die meisten Zellen mit dem Baculovirus infiziert werden, mit einer minimalen Anzahl von Zelltod.Wir haben hier die Herstellung und Aufreinigung des AAV-Vektors des Serotyps 2 als Modell beschrieben. Das Protokoll kann jedoch auch für andere AAV-Serotypen angewendet werden.

Research

JoVE Journal

Biology

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Biologie

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