Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר רוברט מ. קוטין (המכון הלאומי ללב, דם ולריאות, NIH) על שסיפק לנו בנדיבות את הפלסמידים של AAV ודניאל סטיל ורבקה ארנסט (בית החולים לילדים בסינסינטי) על הסיוע הטכני שלהם. עבודה זו נתמכת על ידי קרן הסטארט-אפ מקרן סינסינטי לחקר הילדים ל- M.N.

ראה איור 1 לקבלת איור המסכם את הפרוטוקול.
1. דור תאי טיפים נגועים בבקולווירוס
<ol><li>להפשיר בישול אחד של תאי Sf9 ומיד לזרוע אותם ב 50 מ"ל של מדיום תרבית תאי חרקים. לגדל תאי Sf9 באינקובטור שייקר מסלולית ב 125 סל"ד ו 28 °C בבקבוקונים התחתונים העגולים עם כובע מחובר באופן רו?...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

הפרמטרים המשמשים בפרוטוקול זה לפיתוח תהליך הייצור, הטיהור והריכוז של וקטורים AAV ניתן להחיל הן ייצור קטן בקנה מידה גדול של וקטורים AAV עבור יישומי ריפוי גנטי. ניתן לבצע את כל התהליך במעלה ובמורד הזרם במערכת סגורה התואמת לנוהלי הייצור הטובים (cGMP) הנוכחיים. היתרונות העיקריים של מערכת Sf9-baculovirus ה...

וירוסים הקשורים לאדנו (AAV) הם פרובווירוסים אנושיים שאינם עוטפים המכילים DNA חד-גדילי של 4.6 kb. לווקטורים AAV יש מספר יתרונות על פני וקטורים ויראליים אחרים עבוריישומי ריפוי גנטי 1,2,3,4. AAVs אינם כשירים באופן טבעי לשכפול, ובכך דורשים וירוס עוזר ומכונות מארחות לשכפול. AAVs אינם גורמים לשום מחלה ויש להם אימונוגניות נמוכה במארח הנגוע3,5. AAV יכול להדביק תאים שיבונים וחלוקה פעילה ועשויים להימשך כאפיוזום מבלי להשתלב בגנום של התאים המארחים (AAV לעתים רחוקות להשתלב בגנום המארח)1,3. תכונות אלה הפכו את AAV לכלי רצוי עבור יישומי ריפוי גנטי.
כדי ליצור וקטור העברת גנים AAV, קלטת transgene, כולל הגן הטיפולי, משובטת בין שתי חזרות מסוף פנימיות (ITRs), אשר נגזרות בדרך כלל סרוטיפ AAV 2. הגודל המרבי מ- ITR בגודל 5 אינץ' ל- ITR של 3 אינץ', כולל רצף הטרנסג'נים, הוא 4.6 kb6. קפידים שונים עשויים להיות תא אחר או טרופיזם רקמה. לכן, capsids צריך להיבחר בהתבסס על הרקמה או סוג התא שנועד להיות ממוקד עם וקטור AAV7.
וקטורים AAV רקומביננטיים מיוצרים בדרך כלל בקווי תאים של יונקים כגון תאי כליה עובריים אנושיים, HEK293 על ידי העברה ארעית של וקטור העברת הגנים AAV, כובע נציג AAV, ווירוס עוזר plasmids2,3. עם זאת, ישנן מספר מגבלות לייצור AAV בקנה מידה גדול על ידי ארעיות של תאי HEK293 חסידים. ראשית, יש צורך במספר רב של ערימות תאים או בקבוקי רולר. שנית, יש צורך בדנ"א פלסמיד באיכות גבוהה ובריגנטים של טרנספקטים, מה שמגדיל את עלות הייצור. לבסוף, בעת שימוש בתאי HEK293 דבקים, הסרום נחוץ לעתים קרובות לייצור אופטימלי, מה שמסבך את העיבוד במורד הזרם1,2,3. שיטה חלופית של ייצור AAV כוללת שימוש בקו תאי החרק, תאי Spodoptera frugiperda (Sf9), ווירוס חרקים הנקרא רקומביננטי חתימה californica וירוס polyhedrosis גרעיני multicapsid (AcMNPV או baculovirus)8,9,10. תאי Sf9 גדלים בתרבית מתלים ללא סרום שקל להגדיל ותואם לייצור בפועל הייצור הטוב הנוכחי (cGMP) בקנה מידה גדול, שאינו דורש ריאגנטים פלסמיד או טרנספקטו. יתר על כן, העלות של ייצור AAV באמצעות מערכת Sf9-baculovirus נמוכה יותר מאשר העלות של שימוש transfection חולף של plasmids לתוך HEK293 תאים11.
מערכת הייצור המקורית של rAAV באמצעות תאי baculovirus-Sf9 השתמשה בשלושה בקולווירוסים: בקולווירוס אחד המכיל קלטת העברת גנים, הבאקולווירוס השני המכיל גן נציג, ואת נגיף הבאקולו השלישי המכיל גן קפסיד ספציפי לסרוטיפ12,13. עם זאת, הבקולווירוס המכיל מבנה נציג היה לא יציב גנטית על סיבובים מרובים של מעברים, אשר מנע הגברה של baculovirus לייצור AAV בקנה מידה גדול. כדי לפתור בעיה זו, פותחה מערכת וקטורית rAAV חדשנית, שהכילה שני בקלווירוסים (TwoBac): אחד baculovirus המכיל את קלטת העברת הגנים AAV ועוד baculovirus המכיל את הגנים rep-cap AAV יחד אשר יציבים יותר מבחינה גנטית מאשר המערכת המקורית ונוח יותר לייצר rAAV בגלל שימוש TwoBac במקום שלושה14, 15. מערכת OneBac משתמשת בקלטת העברת הגנים AAV ובגנים של כובע נציגים בבאקולווירוס יחיד שנוח יותר לייצר את ה- rAAV בגלל שימוש בבאקולווירוס אחד במקום להשתמש ב- TwoBac או ThreeBac2,16,17. במחקר שלנו, מערכת TwoBac שימשה לאופטימיזציה.
מערכת baculovirus לייצור AAV יש גם מגבלות: חלקיקי baculovirus אינם יציבים לאחסון לטווח ארוך בינוני ללא סרום11, ואם titer baculovirus נמוך, יש צורך בנפח גדול של supernatant baculovirus, אשר עלול להיות רעיל לצמיחה של תאי Sf9 במהלך ייצור AAV (תצפית אישית). השימוש בתאי שימור תאים נגועים ללא טיטר והגדלת תאים (TIPS), או תאי חרקים נגועים בבקולווירוס (BIIC), מספק אפשרות טובה לייצור AAV שבהם תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס מוכנים, קריופ שמורים, ולאחר מכן משמשים לזיהום של תאי Sf9 טריים. יתרון נוסף הוא היציבות המוגברת של baculovirus (BV) בתאי Sf9 לאחר cryopreservation10,11.
שני סוגים של תאי TIPS נוצרים כדי לאפשר ייצור AAV: הראשון על ידי זיהום של תאי Sf9 עם BV-AAV2-GFP או גן טיפולי, והשני על ידי זיהום של תא Sf9 עם BV-AAV2-rep-cap. תאי טיפים שמורים ב aliquots קטן ומוכן לשימוש. וקטורים AAV מיוצרים בתרבית מתלים ללא סרום בבקבוקון להציב שייקר מסלולית או bioreactor גל על ידי כת משותפת תאי TIPS המייצרים baculoviruses ותאי Sf9 טריים. תאי Sf9 נגועים בבאקולווירוסים הנושאים את וקטור AAV2-GFP ואת רצפי כובע הנציג כדי ליצור AAV. ארבעה עד חמישה ימים לאחר מכן, כאשר תשואות AAV הן הגבוהות ביותר, תאי היצרן הם lysed עם חומר ניקוי כדי לשחרר את חלקיקי AAV. lysate התא מובהר לאחר מכן על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה וסינון. חלקיקי AAV מטוהרים מהליסאט על ידי כרומטוגרפיה של עמודי AVB ספרוז. לבסוף, וקטורים AAV מרוכזים באמצעות TFF. הפרוטוקול מתאר את הייצור של AAV בקנה מידה קטן, שימושי למחקר ומחקרים פרה קליניים. עם זאת, השיטות ניתנות להרחבה ותואמות לייצור וקטורים AAV ברמה קלינית ליישומי ריפוי גנטי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

וירוסים הקשורים אדנו (AAV) הם וקטורים מבטיחים עבור יישומי ריפוי גנטי. כאן, וקטור AAV2 מיוצר על ידי תרבית משותפת של תאי Spodoptera frugiperda (Sf9) עם תאי Sf9 נגועים בבקולווירוס (BV)-AAV2-GFP (או גן טיפולי) ו- BV-AAV2-rep-cap בתרבית מתלים ללא סרום. תאים מתורבתים בבקבוקון בשייקר מסלולי או ביו-ריאקטור גלים. כדי לשחרר את חלקיקי AAV, תאי היצרן הם lysed במאגר המכיל חומר ניקוי, אשר מובהר לאחר מכן על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה וסינון. חלקיקי AAV מטוהרים מהתא ליסאט באמצעות כרומטוגרפיה של עמודי AVB ספרוז, הקושרת חלקיקי AAV. חלקיקים קשורים נשטפים עם PBS כדי להסיר מזהמים ונבהרים מהשרף באמצעות חיץ נתרן סיטראט ב- pH 3.0. האלואט החומצי מנוטרל עם חיץ Tris-HCl אלקליין (pH 8.0), מדולל עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), ומרוכז עוד יותר עם סינון זרימה משיק (TFF). הפרוטוקול מתאר ייצור וקטורי פרה-קליני בקנה מידה קטן התואם לייצור AAV בקנה מידה גדול עד בקנה מידה קליני עבור יישומי טיפול גנטי אנושי.

כאן, התוצאות הייצוגיות של פיתוח תהליכים לייצור וטיהור של וקטורים AAV באמצעות מערכת תאי החרקים Sf9 מוצגים. השיטה כוללת תרבית משותפת של תאי Sf9 עם תאי TIPS נגועים בבקולווירוס, הזנת התאים עם מדיום גדילה, קצירה ותזה של תאי המפיק כדי לשחרר את חלקיקי AAV, הבהרה של ליסאט התא עם טיפול נוקלאז, צנטריפוגה וסינ...

Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

בפרוטוקול זה, וקטור AAV2 מיוצר על ידי פולחן שותף Spodoptera frugiperda (Sf9) תאים חרקים עם baculovirus (BV)-AAV2-חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או גן טיפולי ותאי Sf9 נגועים BV-AAV2-rep בתרבית השעיה. חלקיקי AAV משתחררים מהתאים באמצעות חומר ניקוי, מובהר, מטוהר על ידי כרומטוגרפיה של עמודת זיקה, ומרוכזים על ידי סינון זרימה משיק.

פיתוח תהליכים לייצור וטיהור של וירוס הקשורים לאדנו (AAV)2 וקטור באמצעות מערכת תרבית תאים של חרקים בקלווירוס

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור החוקרים שרוצים לפתח שיטות לייצור AAV וטיהור באמצעות מערכת תרבית תאים baculovirus-חרק. ייצור AAV באמצעות מערכת תרבית תאים baculovirus-חרקים היא שיטה חסכונית כי הוא קל להגדיל והוא תואם את תרגול הייצור הטוב הנוכחי. חלקים מסוימים של הפרוטוקול יודגמו על ידי אלן הייזר, עוזר מחקר של המעבדה שלי.התחל על ידי הפשרת מקטורינה אחת של תאי Sf9, ומיד לזרוע אותם ב 15 מיליליטר של מדיום תרבית תאי חרקים. לגדל תאי Sf9 באינקובטור שייקר מסלולית ב 125 סל"ד ו 28 מעלות צלזיוס בבקבוקונים עגולים עם כובע מחובר באופן רופף לחילופי אוויר. להפיץ את התאים בבקבוקון ליטר אחד המכיל 200 מיליליטר של בינוני כדי להשיג מספיק תאים לייצור תאי TIPS.הוסף 50 מיליליטר של תאי Sf9 ב 2 כפול 10 לתאי כוח 6 למיליליטר בשני צלוחיות. להדביק בקבוקון אחד של תאי Sf9 עם 0.5 מיליליטר של baculovirus-AAV2-GFP, ואת הבקבוקון השני של תאים עם 0.5 מיליליטר של baculovirus-AAV2-rep-cap. שלושה ימים לאחר מכן, לקצור aliquot קטן של תאי Sf9 נגועים baculovirus, הידוע גם בשם תאי TIPS.כתם 2 כפול 10 בחזקת ה-5 של תאי Sf9 לא נגועים ונגועים בבקולווירוס עם 0.5 מיקרוגרם של נוגדן נגד בקולווירוס gp64 של עכבר המכיל צבע פלואורסצנטי ב-100 מיקרוליטרים של חסימת חוצץ למשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה בחושך. לאחר שטיפת התאים עם PBS כדי להסיר את הנוגדן, להשעות מחדש את התאים המוכתמים ב 300 microliters של PBS המכיל 0.5 אלבומין סרום בקר. לנתח את הביטוי baculovirus gp64 על תאים באמצעות cytometry זרימה.כאשר התאים הם 80 עד 90%קיימא, עם עלייה בקוטר, לקצור את התאים cryopreserve 1 פעמים 10 כדי 7 תאי כוח מיליליטר של מדיום תרבית חרקים, מוחלף עם 10% סרום שור עוברי ו 10% דימתיל סולפוקסיד במיכל הקפאה איטית ב 80 מעלות צלזיוס שליליות. למחרת, להעביר את הצינור המכיל תאי TIPS למקפיא חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. תרבות ולגדל תאי Sf9 נאיביים ב 2 כפול 10 עד 6 תא כוח למיליליטר ב 28 מעלות צלזיוס בכמה צלוחיות שני ליטר המכיל 400 מיליליטר של מדיום תרבית תאי חרקים בחממה שייקר הדרושה לווירוס הקשור לאדנו או לייצור AAV.לאחר שלושה עד ארבעה ימים, צפיפות התאים גדלה עד 5 עד 6 כפול 10 עד 6 תאי כוח למיליליטר. לייצור AAV בבקבוקונים באינקובטור שייקר מסלולית, השתמש בפיפטה או במשאבה פרייסטלית כדי לזרוע 400 מיליליטר של תרבית Sf9 ב 2 כפול 10 עד 6 תאי כוח למיליליטר לתוך בקבוקון שני ליטר, באופן אספטי. הגדירו את שייקר המסלול ב-125 סל"ד ו-28 מעלות צלזיוס.הפשירו מעין אחד של כל תאי טיפה של באקולווירוס-AAV-GFP ובאקולווירוס-AAV-rep-cap TIPS. לדלל את התאים עם 20 מיליליטר של מדיום תרבית חרקים, ולבצע ספירת הכדאיות של התאים באמצעות כחול טריפן. לחסן את שני תאי TIPS ביחס של 1 עד 10, 000 ביחס לתאי Sf9 נאיביים בתרבית בקבוקון שייקר או ביו-כור.ביום השני, לקצור מיליליטר אחד של תרבות Sf9 aseptically, וכתם עם צבע כחול טריפן כדי לנתח את ספירת התאים, הכדאיות, ומורפולוגיה. ביום השלישי, חזור על השלבים שבוצעו ביום השני, ובדוק את מצב זיהום baculovirus לאחר הכתמת תאי Sf9. ביום החמישי, חזור על השלבים שבוצעו ביום השני, ולאחר מכן לקצור את המדיום התרבותי ואת התאים כאשר הכדאיות Sf9 ירדה לסביבות 50%לאסוף את supernatant ואת גלולה התא לאחר ספינינג, ולאחסן אותם ב מינוס 80 מעלות צלזיוס.לאחר הפשרת גלולה תא AAV-היצרן, להוסיף חוצץ תמוגה תא לתערובת במרץ. לדגור את הכדור מושעה מחדש במשך 30 דקות בטמפרטורת הסביבה כדי לשחרר את חלקיקי AAV. לאחר צנטריפוגה, להעביר את התא lysate למיכל חדש.מערבבים את lysate התא ואת תרבית התא supernatant לאחר הפשרה. הוסף 20 יחידות למיליליטר נוקלאז ומגנזיום כלוריד 10 מילימולרי לתא ליסאט כדי לעכל את ה- DNA וה- RNA, ודגור במשך שעתיים עד ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס. סנן את הליזאט באמצעות מיקרומטר 0.8 ומערכת סינון כפול של פוליאתרסולפון 0.2 מיקרו באמצעות משאבה.יש לאחסן את התא המובהק ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או לטהר את ה-AAV באופן מיידי. הר עמוד AVB ספרוז 10 מיליליטר על מכונת הכרומטוגרפיה, והכנס את הצינור לתוך דגימת AAV, חוצץ לשטוף, חוצף elution. הכנס צינורות לחריצי אספן השברים של מכונת הכרומטוגרפיה כדי לאסוף את שברי הפתרון העובר בעמודה, מאגר הכביסה ומאגר ההבחנה המכיל את חלקיקי AAV.שיד את העמודה AVB Sepharose עם חמישה כרכים בעמודה של PBS בקצב זרימה של חמישה מיליליטר לדקה. טען את ליסאט התא המסונן המכיל חלקיקי AAV על עמוד הזיקה AVB Sepharose באמצעות מכונת הכרומטוגרפיה המצוידת במשאבת דגימה. הפעל את המדגם בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה.הפעל PBS דרך העמודה בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה עד עקומת הספיגה האולטרה סגולה ב 280 ננומטר חוזר לקו הבסיס והופך יציב. יש לבחון את חלקיקי AAV מעמודת AVB Sepharose עם נתרן סיטראט 50 מילימולרים חוצץ pH 3 בקצב זרימה של שלושה מיליליטר לדקה. מיד לדלל את supernatant AAV עם נפח חמישית של 500 מילימולר Tris HCl pH 8.0 כדי לנטרל את מאגר האליטה החומצי המכיל AAV.פעולה זו מונעת השפלה בתיווך pH שעלולה להתרחש עם מאגר חומצי pH 3.0 elution. לאחר מכן לדלל את AAV supernatant פי עשרה עם PBS, כך חלקיקי AAV נמצאים במאגר פיזיולוגי. יש לאחסן מיליליטר אחד של כל דגימות ריצה, חוצץ כביסה ו-100 מיקרוליטרים של ה-AAV הנלהב כדי להעריך את נוכחותו של AAV על ידי זיהום של תאי היעד.הגדר את מערכת סינון הזרימה המשיק, מצויד מחסנית קרום polyethersulfone עם 100 קילודלטון משקל מולקולרי ניתוק כדי לרכז את AAV. הפעל 200 מיליליטר של PBS במשך 10 דקות כדי לשרטט את מודול סינון זרימה משיק. טען את דגימת AAV על ידי שליטה בזרימת המשאבה עד שהדגימה מצטמצמת לנפח הרצוי.דילפלט את ההטנטציה מחדש עם 100 מיליליטר של PBS. לאחר ריכוז דגימת AAV לנפח הרצוי, אסוף את דגימת AAV, סנן אותו דרך מסנן פוליאתרסולפון 0.2 מיקרומטר, ועליקט אותו. לאחר מכן לאחסן את מדגם AAV ב מינוס 80 מעלות צלזיוס.רוב תאי Sf9 נדבקו בנגיף הבאקולו בשלושה עד ארבעה ימים, בשל סבבי ההדבקה המרובים, עדות לביטוי gp64 baculovirus gp64. רוב התאים גם מראים עלייה בקוטר. התאים מראים עלייה בקוטר, אפקט ציטוטופתי, וכמחצית מהתאים מתים בחמישה ימים לאחר ההדבקה, שהם הסימנים להשלמת הייצור של AAV.שיא של חלבון נראה תוך כדי אלוטציה עם חוצץ חומצי המתאים לשבר AAV. דגימות ה-AAV המטוהרות מציגות שלושה חלבוני קבסיד נפרדים: VP1, VP2 ו-VP3, לאחר כתמי SDS-PAGE וכסף. הצעד הקריטי ביותר הוא קצירת תאי TIPS לפני cryopreservation, כאשר רוב התאים להיות נגועים baculovirus, עם מספר מינימלי של מוות תאים.תיארנו את הייצור והטיהור של וקטור AAV של סרוטיפ 2 כמודל כאן. עם זאת, ניתן להחיל את הפרוטוקול גם על סרוטיפים אחרים של AAV.

Research

JoVE Journal

Biology

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

מערכת סגורה Cell תרבות פרוטוקול באמצעות כלי HYPERStack עם טכנולוגיה חומר חדיר גז

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

פורסים תרבות השיטה למעקב אחר ההתפתחות של חיידקים בשיני explant תרבות

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

תרבות הגוף השמן איברים במערכת Aedes Aegypti, וקטור של וירוס Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

וזמינותו חשופה כמותיים נקודה עבור טיטור AAV והשימוש בה להערכה תפקודית של וירוס Adeno-הקשורים ההרכבה-הפעלת חלבונים

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

יצירת עכברי נוקאאוט ספציפיים לשומן חום באמצעות מערכת RNA חד-מנחה משולבת של Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ו-Adeno-Associated Virus

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...