Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Vorremmo ringraziare il Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) per averci generosamente fornito i plasmidi AAV e Danielle Steele e Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è supportato dal fondo Start-Up dalla Cincinnati Children's Research Foundation a M.N.

Vedere la Figura 1 per un'illustrazione che riepiloga il protocollo.
1. Generazione di cellule TIPS infette da baculovirus
<ol><li>Scongelare una fiala di cellule Sf9 e seminarle immediatamente in 50 ml di terreno di coltura cellulare di insetti. Coltiva celle Sf9 in un incubatore shaker orbitale a 125 giri/min e 28 °C in palloni a fondo tondo con un tappo liberamente fissato per lo scambio d'aria8,9. P...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

I parametri utilizzati in questo protocollo per lo sviluppo del processo di produzione, purificazione e concentrazione di vettori AAV possono essere applicati sia alla produzione su piccola che su larga scala di vettori AAV per applicazioni di terapia genica. L'intero processo a monte e a valle può essere eseguito in un sistema chiuso compatibile con le attuali Good Manufacturing Practices (cGMP). I principali vantaggi del sistema Sf9-baculovirus sono la scalabilità per la produzione di AAV di livello GMP su larga scal...

I virus adeno-associati (AAV) sono parvovirus umani non avvolti contenenti un DNA a singolo filamento di 4,6 kb. I vettori AAV hanno diversi vantaggi rispetto ad altri vettori virali per applicazioni di terapiagenica 1,2,3,4. Gli AAV sono naturalmente incompetenti per la replicazione, quindi richiedono un virus helper e un meccanismo ospite per la replicazione. Gli AAV non causano alcuna malattia e hanno una bassa immunogenicità nell'ospite infetto3,5. L'AAV può infettare sia le cellule quiescenti che quelle che si dividono attivamente e può persistere come episoma senza integrarsi nel genoma delle cellule ospiti (AAV raramente si integra nel genoma dell'ospite)1,3. Queste caratteristiche hanno reso AAV uno strumento desiderabile per le applicazioni di terapia genica.
Per generare un vettore di trasferimento genico AAV, la cassetta transgenica, incluso il gene terapeutico, viene clonata tra due ripetizioni terminali interne (ITR), che sono tipicamente derivate dal sierotipo AAV 2. La dimensione massima da 5' ITR a 3' ITR, compresa la sequenza transgenica, è 4,6 kb6. Capsidi diversi possono avere un diverso tropismo cellulare o tissutale. Pertanto, i capsidi dovrebbero essere scelti in base al tessuto o al tipo di cellula destinati ad essere presi di mira con il vettore AAV7.
I vettori AAV ricombinanti sono comunemente prodotti in linee cellulari di mammiferi come le cellule renali embrionali umane, HEK293 per trasfezione transitoria del vettore di trasferimento genico AAV, AAV rep-cap e plasmidi del virus helper2,3. Tuttavia, ci sono diverse limitazioni per la produzione di AAV su larga scala mediante trasfezione transitoria di cellule HEK293 aderenti. In primo luogo, è necessario un gran numero di pile di celle o bottiglie a rulli. In secondo luogo, sono necessari DNA plasmidico di alta qualità e reagenti di trasfezione, il che aumenta il costo di produzione. Infine, quando si utilizzano cellule HEK293 aderenti, il siero è spesso necessario per una produzione ottimale, complicando la lavorazione a valle1,2,3. Un metodo alternativo di produzione AAV prevede l'utilizzo della linea cellulare di insetti, cellule Spodoptera frugiperda (Sf9) e un virus di insetti chiamato virus ricombinante Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV o baculovirus)8,9,10. Le cellule Sf9 sono coltivate in colture in sospensione senza siero che è facile da scalare ed è compatibile con l'attuale produzione di buone pratiche di fabbricazione (cGMP) su larga scala, che non richiede plasmidi o reagenti di trasfezione. Inoltre, il costo della produzione di AAV utilizzando il sistema Sf9-baculovirus è inferiore al costo dell'utilizzo della trasfezione transitoria di plasmidi in cellule HEK29311.
Il sistema di produzione rAAV originale che utilizzava cellule baculovirus-Sf9 utilizzava tre baculovirus: un baculovirus contenente cassetta di trasferimento genico, il secondo baculovirus contenente gene rep e il terzo baculovirus contenente il gene del capside sierotipo specifico12,13. Tuttavia, il costrutto di rep contenente baculovirus era geneticamente instabile su più cicli di passaggi, il che impediva l'amplificazione del baculovirus per la produzione di AAV su larga scala. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un nuovo sistema vettoriale rAAV, che conteneva due baculovirus (TwoBac): un baculovirus contenente la cassetta di trasferimento genico AAV e un altro baculovirus contenente i geni AAV rep-cap insieme che sono geneticamente più stabili del sistema originale e più convenienti per produrre rAAV a causa dell'utilizzo di TwoBac invece di tre14, 15. Il sistema OneBac utilizza la cassetta di trasferimento genico AAV e i geni rep-cap in un singolo baculovirus che è più conveniente per produrre il rAAV a causa dell'utilizzo di un baculovirus invece di utilizzare TwoBac o ThreeBac2,16,17. Nel nostro studio, il sistema TwoBac è stato utilizzato per l'ottimizzazione.
Il sistema di baculovirus per la produzione di AAV ha anche dei limiti: le particelle di baculovirus sono instabili per la conservazione a lungo termine nel mezzo privo di siero11e se il titolo del baculovirus è basso, è necessario un grande volume di surnatante di baculovirus, che può diventare tossico per la crescita delle cellule Sf9 durante la produzione di AAV (osservazione personale). L'uso di cellule TIPS (Tip) senza titolo di conservazione e scale-up delle cellule infette da titolo, o cellule di insetti infette da baculovirus (BIIC), fornisce una buona opzione per la produzione di AAV in cui le cellule Sf9 infette da baculovirus vengono preparate, crioconservate e successivamente utilizzate per l'infezione di cellule Sf9 fresche. Un altro vantaggio è la maggiore stabilità del baculovirus (BV) nelle cellule Sf9 dopo crioconservazione10,11.
Vengono generati due tipi di cellule TIPS per consentire la produzione di AAV: la prima per infezione di cellule Sf9 con il BV-AAV2-GFP o gene terapeutico, e la seconda per infezione della cellula Sf9 con BV-AAV2-rep-cap. Le cellule TIPS sono crioconservate in aliquote piccole e pronte all'uso. I vettori AAV sono prodotti in coltura di sospensione priva di siero in un pallone posto in uno shaker orbitale o bioreattore Wave co-coltivando cellule TIPS che producono baculovirus e cellule Sf9 fresche. Le cellule Sf9 sono infettate da baculovirus che trasportano il vettore AAV2-GFP e le sequenze rep-cap per generare AAV. Quattro o cinque giorni dopo, quando le rese AAV sono le più alte, le cellule produttrici vengono lisate con detergente per rilasciare le particelle AAV. Il lisato cellulare viene successivamente chiarito mediante centrifugazione e filtrazione a bassa velocità. Le particelle AAV vengono purificate dal lisato mediante cromatografia a colonna di sefarosio AVB. Infine, i vettori AAV sono concentrati utilizzando TFF. Il protocollo descrive la produzione di AAV su piccola scala, utile per la ricerca e gli studi pre-clinici. Tuttavia, i metodi sono scalabili e compatibili con la produzione di vettori AAV di grado clinico per applicazioni di terapia genica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

I virus adeno-associati (AAV) sono vettori promettenti per le applicazioni di terapia genica. Qui, il vettore AAV2 è prodotto dalla co-coltura di cellule di Spodoptera frugiperda (Sf9) con cellule Sf9 infettate da baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gene terapeutico) e BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione senza siero. Le cellule vengono coltivate in un pallone in uno shaker orbitale o in un bioreattore Wave. Per rilasciare le particelle AAV, le cellule produttrici vengono lisate in un tampone contenente detergente, che viene successivamente chiarito mediante centrifugazione e filtrazione a bassa velocità. Le particelle AAV vengono purificate dal lisato cellulare utilizzando la cromatografia a colonna AVB Sepharose, che lega le particelle AAV. Le particelle legate vengono lavate con PBS per rimuovere i contaminanti ed eluite dalla resina utilizzando un tampone di citrato di sodio a pH 3,0. L'eluato acido viene neutralizzato con tampone alcalino Tris-HCl (pH 8,0), diluito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e ulteriormente concentrato con filtrazione a flusso tangenziale (TFF). Il protocollo descrive la produzione di vettori pre-clinici su piccola scala compatibile con la produzione AAV di grado clinico su larga scala per applicazioni di terapia genica umana.

Qui vengono mostrati i risultati rappresentativi dello sviluppo del processo per la produzione e la purificazione di vettori AAV utilizzando il sistema cellulare di insetti Sf9. Il metodo include la co-coltura di cellule Sf9 con cellule TIPS infette da baculovirus, l'alimentazione delle cellule con terreno di crescita, la raccolta e la lisi delle cellule produttrici per rilasciare le particelle AAV, la chiarificazione del lisato cellulare con trattamento della nucleasi, la centrifugazione e la filtrazione, la purificazio...

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Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In questo protocollo, il vettore AAV2 è prodotto co-coltivando cellule di insetti Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) o gene terapeutico e cellule Sf9 infette da BV-AAV2-rep-cap in coltura in sospensione. Le particelle AAV vengono rilasciate dalle cellule utilizzando detergente, chiarificate, purificate mediante cromatografia a colonna di affinità e concentrate mediante filtrazione a flusso tangenziale.

Sviluppo del processo per la produzione e la purificazione del vettore adeno-associato al virus (AAV)2 utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Questo protocollo sarà utile per i ricercatori che vogliono sviluppare metodi per la produzione e la purificazione di AAV utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto. La produzione di AAV utilizzando il sistema di coltura cellulare baculovirus-insetto è un metodo economico che è facile da scalare ed è compatibile con le attuali buone pratiche di fabbricazione. Alcune parti del protocollo saranno dimostrate da Alan Heizer, un assistente di ricerca del mio laboratorio.Inizia scongelando una fiala di cellule Sf9 e seminale immediatamente in 15 millilitri di terreno di coltura cellulare di insetti. Coltiva cellule Sf9 in un incubatore shaker orbitale a 125 RPM e 28 gradi Celsius in palloni a fondo tondo con un cappuccio liberamente fissato per lo scambio d'aria. Propagare le cellule in un pallone da un litro contenente 200 millilitri di terreno per ottenere abbastanza celle per la produzione di cellule TIPS.Aggiungere 50 millilitri di celle Sf9 a 2 volte 10 alle 6 celle di potenza per millilitro in due palloni. Infettare un pallone di cellule Sf9 con 0,5 millilitri di baculovirus-AAV2-GFP e l'altro pallone di cellule con 0,5 millilitri di baculovirus-AAV2-rep-cap. Tre giorni dopo, raccogli una piccola aliquota di cellule Sf9 infette da baculovirus, note anche come cellule TIPS.Macchiare 2 volte 10 alla quinta potenza di cellule Sf9 non infette e infette da baculovirus con 0,5 microgrammi di anticorpo anti-baculovirus gp64 di topo contenente un colorante fluorescente in 100 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Dopo aver lavato le cellule con PBS per rimuovere l'anticorpo, sospendere nuovamente le cellule colorate in 300 microlitri di PBS contenenti 0,5 albumina sierica bovina. Analizzare l'espressione del baculovirus gp64 sulle cellule utilizzando la citometria a flusso.Quando le cellule sono vitali dall'80 al 90%, con un aumento del diametro, raccogliere le cellule e crioconservare 1 volte 10 alle cellule di 7a potenza in un millilitro di terreno di coltura di insetti, soppiantato con il 10% di siero bovino fetale e il 10% di dimetilsolfossido in un contenitore a congelamento lento a 80 gradi Celsius negativi. Il giorno successivo, trasferire il tubo contenente le celle TIPS in un congelatore ad azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Coltiva e coltiva cellule Sf9 naïve a 2 volte 10 alla 6a cella di potenza per millilitro a 28 gradi Celsius in diversi palloni da due litri contenenti 400 millilitri di terreno di coltura cellulare di insetti in un incubatore shaker necessario per la produzione di virus adeno-associati o AAV.Dopo tre o quattro giorni, la densità cellulare viene aumentata fino a 5-6 volte 10 alle 6 celle di potenza per millilitro. Per la produzione di AAV in palloni in un incubatore shaker orbitale, utilizzare una pipetta o una pompa peristaltica per seminare 400 millilitri di coltura Sf9 a 2 volte 10 alla 6a cella di potenza per millilitro in un pallone da due litri, in modo asettico. Impostare lo shaker orbitale a 125 RPM e 28 gradi Celsius.Scongelare una fiala di ogni cellula TIPS baculovirus-AAV-GFP e baculovirus-AAV-rep-cap. Diluire le cellule con 20 millilitri di terreno di coltura degli insetti ed eseguire un conteggio di vitalità delle cellule usando il tripano blu. Inoculare entrambe le cellule TIPS con un rapporto compreso tra 1 e 10.000 rispetto alle cellule Sf9 naïve coltivate in un pallone shaker o in un bioreattore.Il secondo giorno, raccogliere un millilitro di coltura Sf9 in modo asettico e colorare con il colorante blu tripano per analizzare il numero di cellule, la vitalità e la morfologia. Il terzo giorno, ripetere i passaggi eseguiti il secondo giorno e controllare lo stato dell'infezione da baculovirus dopo aver macchiato le cellule Sf9. Il quinto giorno, ripetere i passaggi eseguiti il secondo giorno, quindi raccogliere il terreno di coltura e le cellule quando la vitalità di Sf9 è diminuita a circa il 50% Raccogliere il surnatante e il pellet cellulare dopo la rotazione e conservarli a 80 gradi Celsius negativi.Una volta scongelato il pellet cellulare produttore di AAV, aggiungere il tampone di lisi cellulare e mescolare vigorosamente. Incubare il pellet ri-sospeso per 30 minuti a temperatura ambiente per rilasciare le particelle AAV. Dopo la centrifugazione, trasferire il lisato cellulare in un nuovo contenitore.Mescolare il lisato cellulare e il surnatante di coltura cellulare dopo lo scongelamento. Aggiungere 20 unità per millilitro nucleasi e cloruro di magnesio 10 millimolare al lisato cellulare per digerire il DNA e l'RNA e incubare per due o quattro ore a 37 gradi Celsius. Filtrare il lisato attraverso un sistema di doppia filtrazione in polietersolfone da 0,8 micrometri e 0,2 micrometri utilizzando una pompa.Conservare il lisato cellulare chiarificato a quattro gradi Celsius durante la notte o purificare immediatamente l'AAV. Montare una colonna di sefarosio AVB da 10 millilitri sulla macchina per cromatografia e inserire la tubazione nel campione AAV, nel tampone di lavaggio e nel tampone di eluizione. Inserire i tubi nelle fessure del collettore di frazioni della macchina per cromatografia per raccogliere le frazioni di soluzione passante della colonna, tampone di lavaggio e tampone di eluizione contenenti le particelle AAV.Equilibrare la colonna AVB Sepharose con cinque volumi di colonne di PBS ad una portata di cinque millilitri al minuto. Caricare il lisato cellulare filtrato contenente particelle AAV sulla colonna di affinità AVB Sepharose utilizzando la macchina cromatografica dotata di una pompa campione. Eseguire il campione a una portata di tre millilitri al minuto.Eseguire PBS attraverso la colonna a una portata di tre millilitri al minuto fino a quando la curva di assorbanza ultravioletta a 280 nanometri ritorna alla linea di base e diventa stabile. Eluire le particelle AAV dalla colonna AVB Sepharose con tampone di citrato di sodio 50 millimolari pH 3 ad una portata di tre millilitri al minuto. Diluire immediatamente il surnatante AAV con un quinto del volume di Tris HCl 8.0 da 500 millimolari per neutralizzare il tampone di eluizione acida contenente AAV.Ciò impedisce la degradazione mediata dal pH che potrebbe verificarsi con il tampone di eluizione a pH 3,0 acido. Quindi diluire il surnatante AAV dieci volte con PBS, in modo che le particelle AAV siano in un tampone fisiologico. Conservare un millilitro di ciascun campione run-through della colonna, tampone di lavaggio e 100 microlitri del surnatante AAV eluito per valutare la presenza di AAV per infezione delle cellule bersaglio.Impostare il sistema di filtrazione a flusso tangenziale, dotato di una cartuccia a membrana di polietersolfone con un taglio di peso molecolare di 100 kilodalton per concentrare l'AAV. Eseguire 200 millilitri di PBS per 10 minuti per bilanciare il modulo di filtrazione a flusso tangenziale. Caricare il campione AAV controllando il flusso della pompa fino a quando il campione non viene ridotto al volume desiderato.Diafiltrare il retentato con 100 millilitri di PBS. Dopo aver concentrato il campione AAV al volume desiderato, raccogliere il campione AAV, filtrarlo attraverso un filtro polietersolfone da 0,2 micrometri e aliquotarlo. Quindi conservare il campione AAV a 80 gradi Celsius negativi.La maggior parte delle cellule Sf9 è stata infettata dal baculovirus in tre o quattro giorni, a causa dei molteplici cicli di infezione, evidenziati dall'espressione della glicoproteina gp64 del baculovirus. La maggior parte delle cellule mostra anche un aumento del diametro. Le cellule mostrano un aumento del diametro, effetto citopatico, e circa la metà delle cellule muore in cinque giorni dopo l'infezione, che sono i segni del completamento della produzione di AAV.Un picco di proteine è stato osservato durante l'eluizione con un tampone acido corrispondente alla frazione AAV. I campioni AAV purificati mostrano tre distinte proteine del capside: VP1, VP2 e VP3, dopo SDS-PAGE e colorazione dell'argento. Il passo più critico è la raccolta delle cellule TIPS prima della crioconservazione, quando la maggior parte delle cellule viene infettata dal baculovirus, con un numero minimo di morte cellulare.Abbiamo descritto la produzione e la purificazione del vettore AAV del sierotipo 2 come modello qui. Tuttavia, il protocollo può essere applicato anche per altri sierotipi AAV.

Research

JoVE Journal

Biology

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Ricerca

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