Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
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우리는 로버트 M. 코틴 박사 (국립 심장, 혈액 및 폐 연구소, NIH) 우리에게 AAV 플라스미드와 다니엘 스틸과 레베카 에른스트 (신시내티 어린이 병원)를 아낌없이 제공하는 데 감사드립니다. 이 작품은 신시내티 아동 연구 재단에서 M.N에 이르는 스타트업 기금에 의해 지원됩니다.

프로토콜을 요약한 그림 1을 참조하십시오.
1. 바쿨로바이러스 감염 팁 세포의 생성
<ol><li>Sf9 세포의 한 유리병을 해동하고 곤충 세포 배양 배지의 50mL에 즉시 종자. 125 rpm및 28°C의 궤도 셰이커 인큐베이터에서 Sf9 세포를 성장시키고, 28°C를 둥근 바닥 플라스크에서 공기8,9의교환을 위해 느슨하게 부착된 캡을...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

AAV 벡터의 생산, 정제 및 농도의 공정 개발을 위해 이 프로토콜에 사용되는 파라미터는 유전자 치료 응용을 위한 AAV 벡터의 소규모 및 대규모 제조 모두에 적용될 수 있다. 전체 업스트림 및 다운스트림 프로세스는 현재 의 양호한 제조 관행(cGMP)과 호환되는 폐쇄된 시스템에서 수행될 수 있습니다. Sf9-baculovirus 시스템의 주요 장점은 저렴한 비용으로 대규모 GMP 급 AAV 생산을 위한 확장성입니다. 이 ...

Adeno 관련 바이러스(AAV)는 4.6 kb의 단일 좌초 DNA를 포함하는 비 봉투인간 파르보바이러스이다. AAV 벡터는 유전자 치료 응용 프로그램1,2,3,4에대한 다른 바이러스 벡터에 비해 몇 가지 장점이 있다. AAV는 자연적으로 복제할 수 없기 때문에 복제를 위해 도우미 바이러스와 호스트 기계가 필요합니다. AAV는 어떤 질병도 일으키지 않으며 감염된 숙주3,5에서면역원성이 낮다. AAV는 세포를 정지하고 능동적으로 분할하는 세포를 모두 감염시킬 수 있으며 숙주 세포의 게놈에 통합하지 않고 피형으로 지속될 수 있습니다(AAV는 거의 숙주 게놈에 통합되지 않습니다)1,3. 이러한 특징은 AAV유전자 치료 응용 프로그램에 대한 바람직한 도구를 만들었습니다.
AAV 유전자 전달 벡터를 생성하기 위해, 치료 유전자를 포함하는 트랜스진 카세트는, 전형적으로 AAV 혈청형 2로부터 유래되는 2개의 내부 말단 반복(ItRs) 사이에서 복제된다. 5'ITR에서 3' ITR까지의 최대 크기는 트랜스진 서열을 포함하여 4.6 kb6이다. 상이한 capsids는 다른 세포 또는 조직 트로피즘이 있을 수 있습니다. 따라서, 캡시드는 AAV 벡터7로표적화되기 위한 조직 또는 세포 유형에 기초하여 선택되어야 한다.
재조합 AAV 벡터는 일반적으로 인간 배아 신장 세포, HEK293 과도 성 AAV 유전자 전달 벡터, AAV rep-cap 및 도우미 바이러스 플라스미드2,3과같은 포유류 세포주에서 일반적으로 생산된다. 그러나, 부착 HEK293 세포의 일시적인 과도 한 과도 한 연동에 의해 대규모 AAV 생산을 위한 몇 가지 제한이 있다. 첫째, 많은 수의 셀 스택이나 롤러 병이 필요합니다. 둘째, 고품질 플라스미드 DNA 및 트랜스프션 시약이 필요하며, 이는 제조 비용을 증가시킵니다. 마지막으로, 부착된 HEK293 세포를 사용할 때, 혈청은 최적의 생산을 위해 자주 필요하며, 다운스트림 처리1,2,3을복잡하게 만든다. AAV 제조의 대안 방법은 곤충 세포주, 스포드옵테라 검거(Sf9) 세포, 및 재조합 사인 칼리포니카 다중캡슐핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcMNPV 또는 바쿨로바이러스)8,9,10을사용하는 것을 포함한다. Sf9 세포는 확장이 용이하고 플라스미드 또는 트랜스페션 시약을 필요로하지 않는 대규모로 현재의 좋은 제조 관행 (cGMP) 생산과 호환되는 혈청없는 서스펜션 배양에서 재배됩니다. 더욱이, Sf9-바쿨로바이러스 시스템을 이용한 AAV 생산비용은 HEK293세포(11)로플라스미드의 과도한 과도순환을 사용하는 비용보다 낮다.
바쿨로바이러스-Sf9 세포를 이용한 본래의 rAAV 생산 시스템은 유전자 전달 카세트를 함유한 바쿨로바이러스 1개, 렙레유전자를 함유한 제2바쿨로바이러스, 혈청형 특이적 캡시드 유전자12,13을함유한 제3바쿨로바이러스를 사용했다. 그러나, rep 구조를 포함하는 바큘로바이러스는 대규모 AAV 생산을 위한 바쿨로바이러스의 증폭을 방지하는 여러 통로에 유전적으로 불안정했습니다. 이 문제를 해결하기 위해, 새로운 rAAV 벡터 시스템이 개발되었다, 이는 두 개의 바쿨로 바이러스를 포함 (TwoBac): AAV 유전자 전송 카세트를 포함하는 하나의 바큘로 바이러스와 원래 시스템보다 유전적으로 더 안정적이고 3 개의14대신 2박을 사용하기 때문에 rAAV를 생산하는 것이 더 편리AAV를 생산하는 것이 더 편리합니다. 15. OneBac 시스템은 2박 또는 ThreeBac2,16,17을사용하는 대신 하나의 바큘로바이러스를 사용하기 때문에 rAAV를 생산하는 것이 더 편리한 단일 바쿨로바이러스에서 AAV 유전자 전달 카세트 및 렙캡유전자를사용합니다. 우리의 연구에서, TwoBac 시스템은 최적화에 사용되었다.
AAV 생산을 위한 바쿨로바이러스 시스템은 또한 한계가 있습니다: baculovirus 입자는 혈청 없는 매체11에있는 장기 저장을 위한 불안정하고, 바쿨로바이러스 티터가 낮으면, AAV 생산 도중 Sf9 세포의 성장에 유독할 수 있는 바쿨로바이러스 상피제의 다량이 필요합니다 (개인 관측). 티터가 없는 감염세포 보존 및 스케일업(TIPS) 세포 또는 바큘로바이러스감염 곤충 세포(BIIC)의 사용은 바쿨로바이러스감염Sf9 세포가 제조되고, 냉동 보존되고, 이후에 신선한 Sf9 세포의 감염에 사용되는 AAV 생산을 위한 좋은 선택권을 제공한다. 또 다른 장점은 극저온 보존 후 Sf9 세포에서 바쿨로바이러스(BV)의 안정성이 증가하여10,11이다.
팁 세포의 두 가지 유형은 AAV 생산을 가능하게 하기 위하여 생성됩니다: BV-AAV2-GFP 또는 치료 유전자를 가진 Sf9 세포의 감염에 의하여 첫번째, BV-AAV2-rep-cap를 가진 Sf9 세포의 감염에 의하여 두 번째. TIPS 세포는 작고 즉시 사용할 수 있는 알리쿼트에서 냉동 보존됩니다. AAV 벡터는 바쿨로바이러스및 신선한 Sf9 세포를 생성하는 TIPS 세포를 공동 배양하여 궤도 셰이커 또는 웨이브 생물 반응기에 배치된 플라스크에서 혈청 없는 서스펜션 배양으로 생산됩니다. Sf9 세포는 AAV2-GFP 벡터및 렙캡 서열을 운반하는 바큘로바이러스에 의해 감염되어 AAV를 생성한다. 4~5일 후, AAV 수율이 가장 높은 경우, 생산자 세포는 세제로 리세팅되어 AAV 입자를 방출합니다. 세포 용액은 이후 저속 원심 분리 및 여과에 의해 명확화됩니다. AAV 입자는 AVB 세파로즈 컬럼 크로마토그래피에 의해 용해로부터 정제된다. 마지막으로 AAV 벡터는 TFF를 사용하여 농축됩니다. 이 프로토콜은 연구 및 전임상 연구에 유용한 소규모AAV 생산을 설명합니다. 그러나, 이 방법은 유전자 치료 응용을 위한 임상급 AAV 벡터제조와 확장가능하고 호환된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

Adeno 관련 바이러스 (AAV)는 유전자 치료 응용 프로그램에 대한 유망한 벡터입니다. 여기서, AAV2 벡터는 스페큘로바이러스(BV)-AAV2-GFP(또는 치료 유전자) 및 BV-AAV2-rep-rep-cap-serum-free 서스펜션 배양에 감염된 Sf9 세포를 가진 Spodoptera 검소페라(Sf9) 세포의 공동 배양에 의해 생성된다. 세포는 궤도 셰이커 또는 웨이브 생물 반응기에서 플라스크에서 배양됩니다. AAV 입자를 방출하기 위해, 생산자 세포는 세제를 포함하는 완충액으로 용액이 되며, 이는 이후 저속 원심분리 및 여과에 의해 명확화된다. AAV 입자는 AAV 입자를 결합하는 AVB 세포로즈 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 세포 용해로부터 정제됩니다. 바운드 입자는 PBS로 세척되어 오염 물질을 제거하고 pH 3.0에서 구연산 나트륨 버퍼를 사용하여 수지에서 용출된다. 산성 용출은 알칼리성 Tris-HCl 버퍼(pH 8.0)로 중화되고, 인산염 완충식식(PBS)으로 희석되고, 접선 유동 여과(TFF)로 더 농축된다. 이 프로토콜은 인간 유전자 치료 응용 을 위한 대규모 임상 급 AAV 제조에 규모업과 호환되는 소규모 전임상 벡터 생산을 설명합니다.

여기서, Sf9 곤충 세포 시스템을 이용한 AAV 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발의 대표적인 결과가 나타난다. 이 방법은 바쿨로바이러스에 감염된 TIPS 세포를 이용한 Sf9 세포의 공동 배양, AAV 입자를 방출하기 위해 생산자 세포의 수확 및 용해, 뉴클레아제 처리, 원심분리 및 여과, AVB 세포 세포 친화성 을 이용한 AAV의 정제, 1피오포그래피(Tromography)를 포함한다.
<p class="jo...

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Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

본 프로토콜에서, AAV2 벡터는 바쿨로바이러스(BV)-AAV2-녹색 형광단백질(GFP) 또는 BV-AAV2-rep-cap 감염Sf9 세포를 현탁액 배양에서 감염한 Sf9 세포를 결합하여 스포드옵테라 검거다(Sf9) 곤충 세포를 공동 배양하여 생성된다. AAV 입자는 세제, 명확성, 친화열 크로마토그래피에 의해 정제되며 접선 흐름 여과에 의해 농축됨을 사용하여 세포로부터 방출된다.

바쿨로바이러스-곤충세포배양시스템을 이용한 아데노 관련 바이러스(AAV)2 벡터의 생산 및 정화를 위한 공정 개발

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

이 프로토콜은 바쿨로바이러스-곤충 세포 배양 시스템을 이용하여 AAV 생산 및 정화 방법을 개발하려는 조사자들에게 유용할 것이다. 바쿨로바이러스-곤충 세포 배양 시스템을 이용한 AAV 생산은 확장이 용이하며 현재의 양호한 제조 관행과 호환되는 비용 효율적인 방법입니다. 프로토콜의 일부 부분은 앨런 Heizer에 의해 입증 될 것 이다, 내 실험실의 연구 조수.Sf9 세포의 한 유리병을 해동하여 시작하여 곤충 세포 배양 배지의 15 밀리리터에 즉시 종자합니다. 125 RPM에서 궤도 셰이커 인큐베이터에서 Sf9 세포를 성장시키고, 공기 교환을 위해 느슨하게 부착 된 캡으로 둥근 바닥 플라스크에서 섭씨 28도성장하십시오. TIP 세포 생산을 위한 충분한 세포를 얻기 위하여 매체의 200 밀리리터를 포함하는 1 리터 플라스크에서 세포를 전파합니다.2개의 플라스크에 밀리리터 당 6개의 전력 세포에 2회 10에 Sf9 세포의 50 밀리리터를 추가합니다. 바쿨로바이러스-AAV2-GFP의 0.5 밀리리터와 바쿨로바이러스-AAV2-rep-cap의 0.5 밀리리터를 가진 세포의 다른 플라스크를 가진 Sf9 세포의 1개의 플라스크를 감염시. 3 일 후, 바쿨로 바이러스 감염 Sf9 세포의 작은 알리쿼트수확, 또한 TIPS 세포로 알려진.얼룩 2 회 10 에 감염 되지 않은 및 baculovirus 감염 Sf9 세포의 5 번째 힘 마우스 안티 baculovirus gp64 항체의 0.5 마이크로 그램을 포함 하는 100 마이크로 리터의 차단 버퍼의 100 마이크로 리터에 어두운 온도에서 30 분 동안 차단 버퍼. 항체를 제거하기 위해 PBS로 세포를 세척한 후, 0.5소 혈청 알부민을 함유한 PBS의 300마이크로리터에서 스테인드 세포를 다시 중단한다. 유동 세포측정법을 이용하여 세포에 대한 바쿨로바이러스 gp64 발현을 분석한다.세포가 80~90%의 생존가능을 이루면, 직경이 증가하여, 10~7번째 전력세포에서 10배까지 10배의 세포와 저온보존을 곤충 배양 배지1밀리리터로 수확하고, 10%의 태아소 세럼과 10%디메틸 설프리옥스를 음의 80도에서 느린 동결 용기에 넣고 대체한다. 다음 날, TIPS 세포를 함유한 튜브를 액체 질소 냉동고로 옮겨 장기 보관합니다. 아데노 관련 바이러스 또는 AAV 생산에 필요한 셰이커 인큐베이터에서 곤충 세포 배양 배지 400 밀리리터를 함유한 여러 2리터 플라스크에서 밀리리터당 2배에서 6전력 세포까지 2배에서 6번째 전력 세포까지 2배에서 순진한 Sf9 세포를 배양하고 성장시키는 다.3~4일 후, 세포 밀도는 밀리리터당 6번째 전력세포에 대해 10배까지 최대 5~6배까지 증가한다. 궤도 셰이커 인큐베이터에서 플라스크에서 AAV 생산을 위해 파이펫 또는 연막 펌프를 사용하여 2배 10~6번째 전력 셀을 2리터 플라스크로 2배 10시에 Sf9 배양 400밀리리터를 시드한다. 궤도 셰이커를 125 RPM과 섭씨 28도에서 설정합니다.각 바큘로바이러스-AAV-GFP 및 바큘로바이러스-AAV-rep-cap TIPS 세포의 한 유리병을 해동. 곤충 배양 배지의 20 밀리리터로 세포를 희석하고, trypan blue를 사용하여 세포의 생존 수를 수행한다. 셰이커 플라스크 또는 바이오 반응기에서 배양된 순진한 Sf9 세포에 비해 팁 세포를 1 대 10, 000의 비율로 접종한다.둘째 날, Sf9 배양의 1밀리리터를 무균적으로 수확하고, 트라이판 블루 염료로 얼룩을 수확하여 세포 수, 생존가능성 및 형태학을 분석한다. 셋째 날에는 2일째에 수행된 단계를 반복하고, Sf9 세포를 염색한 후 바쿨로바이러스 감염상태를 확인한다. 5일째에는 두 번째 날에 수행된 단계를 반복한 다음, Sf9 생존능력이 약 50%로 감소했을 때 배양 배지와 세포를 수확하여 회전 후 상체및 세포 펠릿을 수집하고 음의 80°C에 저장한다.AAV 생산자 셀 펠릿이 해동되면 셀 리시스 버퍼를 추가하고 적극적으로 섞습니다. AAV 입자를 방출하기 위해 주변 온도에서 30 분 동안 다시 중단 된 펠릿을 배양합니다. 원심분리 후 셀 리세이트를 새 용기로 옮긴다.해동 후 세포 리세이트와 세포 배양 상수체를 섞는다. 밀리리터 뉴클레아제당 20단위와 염화 마그네슘 10개를 세포 용해에 첨가하여 DNA와 RNA를 소화하고 섭씨 37도에서 2~4시간 동안 배양합니다. 펌프를 사용하여 0.8 마이크로미터 및 0.2 마이크로미터 polyethersulfone 이중 여과 시스템을 통해 용액을 필터링합니다.정제된 셀 용해를 하룻밤 사이에 섭씨 4도에 보관하거나 AAV를 즉시 정화합니다. 10밀리리터 AVB 세파로즈 컬럼을 크로마토그래피 기계에 장착하고 파이프라인을 AAV 샘플에 삽입하고 버퍼 및 용출 버퍼를 삽입합니다. 크로마토그래피 기계의 분수 수집슬롯에 튜브를 삽입하여 AAV 입자를 포함하는 컬럼 통과 용액, 세척 버퍼 및 용출 버퍼의 분수를 수집합니다.분당 5밀리리터의 유량으로 5개의 열 량의 PBS로 AVB 세파로즈 컬럼을 평형화합니다. AAV 입자를 함유한 여과된 셀 용하를 샘플 펌프가 장착된 크로마토그래피 기계를 사용하여 AV Sepharose 친화성 컬럼에 적재한다. 분당 3밀리리터의 유량으로 샘플을 실행합니다.280나노미터의 자외선 흡광도 곡선이 기준선으로 돌아와 안정될 때까지 분당 3밀리리터의 유량으로 컬럼을 통해 PBS를 실행한다. 분당 3밀리리터의 유량으로 50밀리알나트륨 구연산 버퍼 pH 3로 AVB 세파로즈 컬럼의 AAV 입자를 엘테. AAV를 함유한 산성 용출 버퍼를 중화시키기 위해 500밀리머 트리스 HCl pH pH 8.0의 5분의 1 부피로 AAV 상체를 즉시 희석한다.이렇게 하면 산성 pH 3.0 용출 버퍼로 발생할 수 있는 pH 매개 저하를 방지할 수 있습니다. 그런 다음 AAV 입자가 생리적 완충제에 있도록 PBS로 AAV 상피 10배를 희석시킵니다. 각 컬럼 런스루 샘플, 세척 버퍼 및 100 마이크로리터를 저장하여 대상 세포의 감염에 의한 AAV의 존재를 평가한다.AAV를 농축하기 위해 100킬로달톤의 분자량 차단이 있는 폴레서술포네 멤브레인 카트리지를 장착한 접선 유동 여과 시스템을 설정합니다. 접선 흐름 여과 모듈을 상형화하기 위해 10분 동안 PBS 200 밀리리터를 실행합니다. 샘플이 원하는 부피로 감소될 때까지 펌프의 흐름을 제어하여 AAV 샘플을 로드합니다.PBS의 100 밀리리터로 보행을 이질합니다. AAV 샘플을 원하는 부피에 농축한 후 AAV 샘플을 수집하고 0.2 마이크로미터 의 폴리테셔설폰 필터를 통해 필터링하고 알리쿼트합니다. 그런 다음 AAV 샘플을 음의 섭씨 80도에 저장합니다.Sf9 세포의 대부분은 바쿨로바이러스 당단백질 gp64 발현에 의해 입증된 감염의 다중 라운드 때문에 3 4 일 안에 바쿨로바이러스에 감염되었다. 세포의 대부분은 또한 직경의 증가를 보여줍니다. 세포는 직경의 증가, 세포 병증 효과, 세포의 약 절반은 5 일 후에 감염 후에 정지한다는 것을 보여줍니다, 이는 AAV 생산의 완료의 표시입니다.단백질의 피크는 AAV 분획에 대응하는 산성 완충제로 용출하는 동안 보였다. 정제된 AAV 샘플은 SDS-PAGE 및 은 염색 후 VP1, VP2 및 VP3의 세 가지 뚜렷한 캡시드 단백질을 보여줍니다. 가장 중요한 단계는 대부분의 세포가 세포 사멸의 최소 수와 함께 바쿨로 바이러스에 감염될 때 냉동 보존 전에 TIPS 세포를 수확하는 것입니다.우리는 여기서 모델로 혈청형 2의 AAV 벡터의 생산 및 정제를 설명했다. 그러나 프로토콜은 다른 AAV 혈청형에도 적용될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

회전 형 바틀 문화 시스템을 사용 로던트 전체 엠브료 문화의 방법

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

연구

생물학

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

가스 투과 재료 기술로 HYPERStack 용기를 사용하여 닫힌 체계의 세포 배양 프로토콜

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

이식편 문화 치아 세균의 개발을 다음과 같은 사항에 대해 슬라이스 문화 방법

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

세포 - 세포 연락이없는 두 세포 유형의 삽입 공동 배양 시스템 개발

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

지방 기관 문화 시스템 Aedes Aegypti, Zika 바이러스 벡터에

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

AAV 적정 및 Adeno 관련 바이러스 어셈블리 활성화의 기능 평가 대 한 그것의 사용에 대 한 양적 점 오 점 분석 결과 단백질

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

식물 숙주에서 딱정벌레 벡터의 바이러스 및 타액 단백질 검출

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

결합된 Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 및 아데노 관련 바이러스 단일 가이드 RNA 시스템을 사용한 갈색 지방 특이적 녹아웃 마우스 생성

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...