Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Vi vil takke Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) for sjenerøst å gi oss AAV-plasmidene og Danielle Steele og Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet støttes av oppstartsfondet fra Cincinnati Children's Research Foundation til M.N.

Se figur 1 hvis du vil se en illustrasjon som oppsummerer protokollen.
1. Generering av baculovirus-infiserte TIPS-celler
<ol><li>Tin ett hetteglass med Sf9-celler og frø dem umiddelbart i 50 ml insektcellekulturmedium. Vokse Sf9 celler i en orbital shaker inkubator ved 125 rpm og 28 °C i runde bunnflasker med en løst festet hette for utveksling av luft8,9. Forplant cellene i en 1 L kolbe som innehold...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

Parametrene som brukes i denne protokollen for prosessutvikling av produksjon, rensing og konsentrasjon av AAV-vektorer, kan brukes på både liten og storskala produksjon av AAV-vektorer for genterapiapplikasjoner. Hele oppstrøms- og nedstrømsprosessen kan utføres i et lukket system som er kompatibelt med gjeldende Good Manufacturing Practices (cGMP). De viktigste fordelene med Sf9-baculovirus-systemet er skalerbarhet for storskala GMP-klasse AAV-produksjon til en overkommelig pris. Systemet trenger ikke dyre plasmid...

Adeno-assosierte virus (AAV) er ikke-innhyllede menneskelige parvovirus som inneholder et enkeltstrenget DNA på 4,6 kb. AAV-vektorer har flere fordeler i forhold til andre virusvektorer for genterapiapplikasjoner1,2,3,4. AAVer er naturlig replikeringsinkompetente, og krever dermed et hjelpervirus og vertsmaskiner for replikering. AAVer forårsaker ingen sykdom og har lav immunogenisitet hos den infiserte verten3,5. AAV kan infisere både passiviserende og aktivt dele celler og kan vedvare som episome uten å integrere seg i genomet til vertscellene (AAV integreres sjelden i vertsgenomet)1,3. Disse funksjonene har gjort AAV til et ønskelig verktøy for genterapiapplikasjoner.
For å generere en AAV-genoverføringsvektor klones transgene kassetten, inkludert det terapeutiske genet, mellom to interne terminalrepriser (ITR), som vanligvis er avledet fra AAV-serotypen 2. Maksimal størrelse fra 5' ITR til 3' ITR, inkludert transgenesekvensen, er 4,6 kb6. Ulike capsids kan ha en annen celle eller vev tropisme. Derfor bør capsids velges basert på vevet eller celletypen som er ment å være målrettet med AAV-vektoren7.
Rekombinante AAV-vektorer produseres ofte i pattedyrcellelinjer som humane embryonale nyreceller, HEK293 ved forbigående transfeksjon av AAV-genoverføringsvektoren, AAV rep-cap og hjelpervirusplasmider2,3. Det er imidlertid flere begrensninger for storskala AAV-produksjon ved forbigående transfeksjon av tilhenger HEK293-celler. For det første er det nødvendig med et stort antall cellebunker eller rulleflasker. For det andre er det nødvendig med plasmid DNA og transfeksjonsreagenser av høy kvalitet, noe som øker produksjonskostnadene. Til slutt, når du bruker tilhenger HEK293-celler, er serumet ofte nødvendig for optimal produksjon, noe som kompliserer nedstrøms prosessering1,2,3. En alternativ metode for AAV-produksjon innebærer å bruke insektcellelinjen, Spodoptera frugiperda (Sf9) celler, og et insektvirus kalt rekombinant Autographa californica multicapsid kjernefysisk polyhedrosevirus (AcMNPV eller baculovirus)8,9,10. Sf9-celler dyrkes i serumfri suspensjonskultur som er lett å skalere opp og er kompatibel med dagens god produksjonspraksis (cGMP) produksjon i stor skala, noe som ikke krever plasmid- eller transfeksjonsreagenser. Videre er kostnaden for AAV-produksjonen ved hjelp av Sf9-baculovirus-systemet lavere enn kostnaden ved å bruke forbigående transfeksjon av plasmider i HEK293-celler11.
Det opprinnelige rAAV-produksjonssystemet ved hjelp av baculovirus-Sf9-celler brukte tre baculovirus: ett baculovirus som inneholder genoverføringskassett, det andre baculoviruset som inneholder rep-gen, og det tredje baculoviruset som inneholder serotype-spesifikt kapsidgen12,13. Imidlertid var baculoviruset som inneholder repkonstruksjon genetisk ustabilt ved flere runder med passasjer, noe som forhindret forsterkning av baculoviruset for den store AAV-produksjonen. For å løse dette problemet ble det utviklet et nytt rAAV-vektorsystem, som inneholdt to baculovirus (TwoBac): ett baculovirus som inneholder AAV-genoverføringskassett og et annet baculovirus som inneholder AAV rep-cap-genene sammen som er genetisk mer stabile enn det opprinnelige systemet og mer praktisk å produsere rAAV på grunn av bruk av TwoBac i stedet for tre14, 15. OneBac-systemet bruker AAV-genoverføringskassett og rep-cap-genene i et enkelt baculovirus som er mer praktisk å produsere rAAV på grunn av bruk av ett baculovirus i stedet for å bruke TwoBac eller ThreeBac2,16,17. I vår studie ble TwoBac-systemet brukt til optimalisering.
Baculovirussystemet for AAV-produksjon har også begrensninger: baculoviruspartikler er ustabile for langvarig lagring i serumfritt medium11, og hvis baculovirustitren er lav, er det nødvendig med et stort volum baculovirus supernatant, som kan bli giftig for veksten av Sf9-celler under AAV-produksjon (personlig observasjon). Bruk av titerfrie infiserte celler og oppskaleringsceller (TIPS) eller baculovirusinfiserte insektceller (BIIC), gir et godt alternativ for AAV-produksjon der baculovirusinfiserte Sf9-celler fremstilles, kryopreservert og deretter brukes til infeksjon av friske Sf9-celler. En annen fordel er økt stabilitet av baculovirus (BV) i Sf9 celler etter kryopreservering10,11.
To typer TIPS-celler genereres for å muliggjøre AAV-produksjon: den første ved infeksjon av Sf9-celler med BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen, og den andre ved infeksjon av Sf9-celle med BV-AAV2-rep-cap. TIPS-celler er kryopreservert i små og bruksklare aliquots. AAV-vektorer produseres i serumfri fjæringskultur i en kolbe plassert i en orbital shaker eller Wave bioreactor ved å kokulturere TIPS-celler som produserer baculovirus og friske Sf9-celler. Sf9 celler er infisert av baculovirus som bærer AAV2-GFP vektoren og rep-cap sekvenser for å generere AAV. Fire til fem dager senere, når AAV-utbyttet er det høyeste, lyser produsentcellene med vaskemiddel for å frigjøre AAV-partiklene. Cellelyset avklares deretter ved lavhastighets sentrifugering og filtrering. AAV-partikler renses fra lysatet ved AVB Sepharose kolonnekromatografi. Til slutt er AAV-vektorer konsentrert ved hjelp av TFF. Protokollen beskriver produksjonen av AAV i liten skala, nyttig for forskning og prekliniske studier. Metodene er imidlertid skalerbare og kompatible med produksjon av AAV-vektorer av klinisk kvalitet for genterapiapplikasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

Adeno-assosierte virus (AAV) er lovende vektorer for genterapiapplikasjoner. Her produseres AAV2-vektoren av Spodoptera frugiperda (Sf9) celler med Sf9-celler infisert med baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) og BV-AAV2-rep-cap i serumfri suspensjonskultur. Celler dyrkes i en kolbe i en orbital shaker eller Wave bioreactor. For å frigjøre AAV-partiklene lyser produsentceller i buffer som inneholder vaskemiddel, som deretter avklares ved lavhastighets sentrifugering og filtrering. AAV-partikler renses fra cellelysatet ved hjelp av AVB Sepharose kolonnekromatografi, som binder AAV-partikler. Bundne partikler vaskes med PBS for å fjerne forurensninger og unngås fra harpiksen ved hjelp av natriumsitratbuffer ved pH 3.0. Den sure eluate er nøytralisert med alkalisk Tris-HCl buffer (pH 8.0), fortynnet med fosfat-bufret saltvann (PBS), og videre konsentrert med tangentiell strømningsfiltrering (TFF). Protokollen beskriver småskala preklinisk vektorproduksjon som er kompatibel med oppskalering til storskala klinisk AAV-produksjon for humane genterapiapplikasjoner.

Her vises de representative resultatene av prosessutvikling for produksjon og rensing av AAV-vektorer ved hjelp av Sf9 insektcellesystem. Metoden inkluderer samkultur av Sf9-celler med baculovirus-infiserte TIPS-celler, fôring av cellene med vekstmedium, høsting og lysis av produsentcellene for å frigjøre AAV-partiklene, avklaring av cellelyset med nukleasebehandling, sentrifugering og filtrering, rensing av AAV ved hjelp av AVB Sepharose affinitetskromatografi og konsentrasjon med TFF (Figur 1</...

Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

I denne protokollen er AAV2 vektor produsert av co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insektceller med baculovirus (BV)-AAV2-grønn fluorescerende protein (GFP) eller terapeutisk gen og BV-AAV2-rep-cap infiserte Sf9 celler i suspensjon kultur. AAV-partikler frigjøres fra cellene ved hjelp av vaskemiddel, avklares, renses av affinitetskolonnekromatografi og konsentreres av tangentiell strømningsfiltrering.

Prosessutvikling for produksjon og rensing av Adeno-assosiert virus (AAV)2 Vektor ved hjelp av Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Denne protokollen vil være nyttig for etterforskerne som ønsker å utvikle metoder for AAV-produksjon og rensing ved hjelp av baculovirus-insektcellekultursystemet. AAV-produksjon ved hjelp av baculovirus-insektcellekultursystem er en kostnadseffektiv metode som er lett å skalere opp og er kompatibel med dagens gode produksjonspraksis. Noen deler av protokollen vil bli demonstrert av Alan Heizer, en forskningsassistent for laboratoriet mitt.Begynn med å tine ett hetteglass med Sf9-celler, og frø dem umiddelbart i 15 milliliter insektcellekulturmedium. Vokse Sf9 celler i en orbital shaker inkubator ved 125 RPM og 28 grader Celsius i rundbunnsflasker med en løst festet hette for utveksling av luft. Forplant cellene i en en-liters kolbe som inneholder 200 milliliter medium for å få nok celler til TIPS celleproduksjon.Tilsett 50 milliliter Sf9-celler ved 2 ganger 10 til sjette kraftceller per milliliter i to kolber. Infiser en kolbe av Sf9-celler med 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-GFP, og den andre kolben av celler med 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-rep-cap. Tre dager senere høster du et lite aliquot av baculovirus-infiserte Sf9-celler, også kjent som TIPS-celler.Flekk 2 ganger 10 til den femte kraften til både uinfiserte og baculovirus-infiserte Sf9-celler med 0,5 mikrogram mus anti-baculovirus gp64 antistoff som inneholder et fluorescerende fargestoff i 100 mikroliter blokkeringsbuffer i 30 minutter ved omgivelsestemperatur i mørket. Etter å ha vasket cellene med PBS for å fjerne antistoffet, må du suspendere de fargede cellene i 300 mikroliter PBS som inneholder 0,5 bovint serumalbumin. Analyser baculovirus gp64-uttrykket på celler ved hjelp av strømningscytometri.Når cellene er 80 til 90% levedyktige, med en økning i diameter, høst cellene og kryopreservere 1 ganger 10 til 7. Neste dag overfører du røret som inneholder TIPS-celler, til en flytende nitrogenfryser for langvarig lagring. Kultur og vokse naive Sf9 celler på 2 ganger 10 til sjette kraftcelle per milliliter ved 28 grader Celsius i flere to-liters kolber som inneholder 400 milliliter insektcellekultur medium i en shaker inkubator som er nødvendig for adeno-assosiert virus eller AAV produksjon.Etter tre til fire dager økes celletettheten til opptil 5 til 6 ganger 10 til sjette kraftceller per milliliter. For AAV-produksjon i kolber i en orbital shaker-inkubator, bruk en pipette eller en peristaltisk pumpe for å frø 400 milliliter Sf9-kultur ved 2 ganger 10 til sjette kraftceller per milliliter i en to-liters kolbe, aseptisk. Sett opp orbital shaker på 125 RPM og 28 grader Celsius.Tine ett hetteglass med hver baculovirus-AAV-GFP og baculovirus-AAV-rep-cap TIPS celler. Fortynn cellene med 20 milliliter insektkulturmedium, og utfør et levedyktighetstall av cellene ved hjelp av trypanblå. Inokuler begge TIPS-cellene i forholdet 1 til 10 000 i forhold til de naive Sf9-cellene som dyrkes i en shakerflaske eller bioreaktor.På dag to høster du en milliliter Sf9-kultur aseptisk, og flekker med trypanblå fargestoff for å analysere celleantallet, levedyktigheten og morfologien. På dag tre gjentar du trinnene som utføres på dag to, og kontrollerer statusen til baculovirusinfeksjonen etter farging av Sf9-cellene. På dag fem gjentar du trinnene som utføres på den andre dagen, og høster deretter kulturmediet og cellene når Sf9-levedyktigheten har redusert til rundt 50%Samle supernatanten og cellepelleten etter spinning, og lagre dem på negative 80 grader Celsius.Når AAV-produsentcellepellet er tint, legg til cellelysbuffer til den og bland kraftig. Inkuber den re-suspenderte pelletsen i 30 minutter ved omgivelsestemperatur for å frigjøre AAV-partiklene. Etter sentrifugering, overfør cellelyset til en ny beholder.Bland cellelyset og cellekulturen supernatant etter opptining. Tilsett 20 enheter per milliliterkjerne og 10 millimolar magnesiumklorid i cellelyset for å fordøye DNA og RNA, og inkuber i to til fire timer ved 37 grader Celsius. Filtrer lysatet gjennom et 0,8 mikrometer og 0,2 mikrometer polyetersulfon dobbeltfiltreringssystem ved hjelp av en pumpe.Oppbevar den avklarte cellelyset ved fire grader Celsius over natten, eller rens AAV umiddelbart. Monter en 10 milliliter AVB Sepharose-kolonne på kromatografimaskinen, og sett rørledningen inn i AAV-prøven, vaskebufferen og elutionbufferen. Sett rør inn i fraksjonssamlersporene på kromatografimaskinen for å samle fraksjonene av kolonnepass-gjennomgående løsning, vaskebuffer og elutionbuffer som inneholder AAV-partiklene.Likevekt AVB Sepharose-kolonnen med fem kolonnevolumer av PBS med en strømningshastighet på fem milliliter per minutt. Last den filtrerte cellelysatet som inneholder AAV-partikler, på AVB Sepharose affinitetskolonnen ved hjelp av kromatografimaskinen utstyrt med en prøvepumpe. Kjør prøven med en strømningshastighet på tre milliliter per minutt.Kjør PBS gjennom kolonnen med en strømningshastighet på tre milliliter per minutt til ultrafiolett absorbanskurve ved 280 nanometer går tilbake til grunnlinjen og blir stabil. Elute AAV partikler fra AVB Sepharose kolonnen med 50 millimolar natrium sitrat buffer pH 3 med en strømningshastighet på tre milliliter per minutt. Fortynn umiddelbart AAV-supernatanten med et femtedels volum på 500 millimolar Tris HCl pH 8.0 for å nøytralisere den sure elutionbufferen som inneholder AAV.Dette forhindrer pH-mediert nedbrytning som kan oppstå med sur pH 3.0 elutionbuffer. Fortynn deretter AAV-supernatanten ti ganger med PBS, slik at AAV-partikler er i en fysiolog buffer. Oppbevar én milliliter av hver kolonne gjennomkjøringsprøver, vaskebuffer og 100 mikroliter av den eluterte AAV-supernatanten for å evaluere tilstedeværelsen av AAV ved infeksjon av målcellene.Sett opp det tangentielle strømningsfiltreringssystemet, utstyrt med en polyetersulfonmembranpatron med en 100 kilodalton molekylvektkutt for å konsentrere AAV. Kjør 200 milliliter PBS i 10 minutter for å likevekte den tangentielle strømningsfiltreringsmodulen. Last inn AAV-prøven ved å kontrollere pumpens strømning til prøven er redusert til ønsket volum.Diafiltrate retentate med 100 milliliter PBS. Etter å ha konsentrert AAV-prøven til ønsket volum, samle AAV-prøven, filtrer den gjennom et 0,2 mikrometer polyethersulfonfilter og aliquot det. Lagre deretter AAV-prøven ved negative 80 grader Celsius.De fleste av Sf9-cellene ble smittet med baculoviruset på tre til fire dager, på grunn av flere runder med infeksjon, det fremgår av baculovirus glykoprotein gp64 uttrykk. De fleste cellene viser også en økning i diameter. Cellene viser en økning i diameter, cytopatisk effekt, og rundt halvparten av cellene dør om fem dager etter infeksjon, som er tegn på ferdigstillelse av AAV-produksjon.En topp protein ble sett mens elution med en sur buffer som tilsvarer AAV-fraksjonen. De rensede AAV-prøvene viser tre distinkte kapsidproteiner: VP1, VP2 og VP3, etter SDS-PAGE og sølvfarging. Det mest kritiske trinnet er å høste TIPS-cellene før kryopreservering, når de fleste cellene blir smittet med baculoviruset, med et minimum antall celledød.Vi har beskrevet produksjon og rensing av AAV vektor av serotype 2 som modell her. Protokollen kan imidlertid også brukes for andre AAV-serotyper.

Research

JoVE Journal

Biology

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex produksjonsplattform på EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

The Slice Kultur Metode for følgende utvikling av Tooth Germs I Eksplantering Kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur system for å studere Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Utvikling av et innlegg Co-kultur System of Two Cellular Typer i fravær av Cell-Cell Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fett kroppen Organ kultur-systemet i Aedes Aegypti, en vektor av Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

En kvantitativ Dot Blot analysen for AAV titrering og bruk for funksjonell vurdering av Adeno-assosiert Virus montering-aktivere proteiner

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Påvisning av virus- og spyttproteiner av en bladhoppervektor i planteverten

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

Generering av brune fettspesifikke knockoutmus ved bruk av et kombinert Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 og adenoassosiert virus enkeltveis RNA-system

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...