Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Nos gustaría agradecer al Dr. Robert M. Kotin (Instituto Nacional del Corazón, la Sangre y los Pulmones, NIH) por proporcionarnos generosamente los plásmidos AAV y a Danielle Steele y Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) por su asistencia técnica. Este trabajo es apoyado por el fondo Start-Up de Cincinnati Children's Research Foundation a M.N.

Consulte la Figura 1 para ver una ilustración que resume el protocolo.
1. Generación de células TIPS infectadas por baculovirus
<ol><li>Descongele un vial de células Sf9 e inmediatamente sembrarlas en 50 ml de medio de cultivo de células de insectos. Cultive células Sf9 en una incubadora agitadora orbital a 125 rpm y 28 °C en matraces de fondo redondo con una tapa suelta para el intercambio de aire8,9</...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

Los parámetros utilizados en este protocolo para el desarrollo del proceso de producción, purificación y concentración de vectores AAV se pueden aplicar tanto a la fabricación a pequeña como a gran escala de vectores AAV para aplicaciones de terapia génica. Todo el proceso ascendente y descendente se puede realizar en un sistema cerrado compatible con las Buenas Prácticas de Fabricación (cGMP) actuales. Las principales ventajas del sistema Sf9-baculovirus son la escalabilidad para la producción de AAV de grado ...

Los virus adenoasociados (AAV) son parvovirus humanos no envueltos que contienen un ADN monocatenario de 4,6 kb. Los vectores AAV tienen varias ventajas sobre otros vectores virales para aplicaciones de terapiagénica 1,2,3,4. Los AAV son naturalmente incompetentes para la replicación, por lo tanto, requieren un virus ayudante y una maquinaria huésped para la replicación. Los AAV no causan ninguna enfermedad y tienen baja inmunogenicidad en el huésped infectado3,5. El AAV puede infectar tanto a las células inactivas como a las que se dividen activamente y puede persistir como episoma sin integrarse en el genoma de las células huésped (los AAV rara vez se integran en el genoma del huésped)1,3. Estas características han hecho de AAV una herramienta deseable para aplicaciones de terapia génica.
Para generar un vector de transferencia de genes AAV, el casete transgénico, incluido el gen terapéutico, se clona entre dos repeticiones terminales internas (ITR), que generalmente se derivan del serotipo AAV 2. El tamaño máximo de 5' ITR a 3' ITR, incluyendo la secuencia transgénica, es de 4,6 kb6. Diferentes cápsides pueden tener un tropismo celular o tisular diferente. Por lo tanto, las cápsides deben elegirse en función del tipo de tejido o célula que se pretende atacar con el vector AAV7.
Los vectores AAV recombinantes se producen comúnmente en líneas celulares de mamíferos como las células renales embrionarias humanas, HEK293 por transfección transitoria del vector de transferencia del gen AAV, AAV rep-cap y plásmidos de virus auxiliares2,3. Sin embargo, existen varias limitaciones para la producción de AAV a gran escala mediante la transfección transitoria de células HEK293 adherentes. Primero, se necesita una gran cantidad de pilas de celdas o botellas de rodillos. En segundo lugar, se necesitan ADN plásmido de alta calidad y reactivos de transfección, lo que aumenta el costo de fabricación. Finalmente, cuando se utilizan células ADHERENTES HEK293, el suero se necesita con frecuencia para una producción óptima, lo que complica el procesamiento posterior1,2,3. Un método alternativo de fabricación de AAV implica el uso de la línea celular de insectos, células de Spodoptera frugiperda (Sf9) y un virus de insecto llamado autografia californica multicápside recombinante virus de poliedrosis nuclear (AcMNPV o baculovirus)8,9,10. Las células Sf9 se cultivan en un cultivo de suspensión sin suero que es fácil de escalar y es compatible con la producción actual de buenas prácticas de fabricación (cGMP) a gran escala, que no requiere plásmidos ni reactivos de transfección. Además, el costo de la producción de AAV utilizando el sistema Sf9-baculovirus es menor que el costo de usar la transfección transitoria de plásmidos en células HEK29311.
El sistema original de producción de rAAV utilizando células baculovirus-Sf9 utilizó tres baculovirus: un baculovirus que contiene casete de transferencia de genes, el segundo baculovirus que contiene el gen rep y el tercer baculovirus que contiene el gen de la cápside específico del serotipo12,13. Sin embargo, el baculovirus que contenía la construcción de rep era genéticamente inestable en múltiples rondas de pasajes, lo que impedía la amplificación del baculovirus para la producción de AAV a gran escala. Para resolver este problema, se desarrolló un nuevo sistema vectorial rAAV, que contenía dos baculovirus (TwoBac): un baculovirus que contiene el cassette de transferencia del gen AAV y otro baculovirus que contiene los genes AAV rep-cap juntos que son genéticamente más estables que el sistema original y más convenientes para producir rAAV debido al uso de TwoBac en lugar de tres14, 15. El sistema OneBac utiliza el casete de transferencia de genes AAV y los genes rep-cap en un solo baculovirus que es más conveniente para producir el rAAV debido al uso de un baculovirus en lugar de usar TwoBac o ThreeBac2,16,17. En nuestro estudio, se utilizó el sistema TwoBac para la optimización.
El sistema de baculovirus para la producción de AAV también tiene limitaciones: las partículas de baculovirus son inestables para el almacenamiento a largo plazo en medio libre de suero11, y si el título de baculovirus es bajo, se necesita un gran volumen de sobrenadante de baculovirus, que puede volverse tóxico para el crecimiento de las células Sf9 durante la producción de AAV (observación personal). El uso de células de preservación y ampliación de células infectadas sin título (TIPS), o células de insectos infectadas por baculovirus (BIIC), proporciona una buena opción para la producción de AAV en la que las células Sf9 infectadas por baculovirus se preparan, criopreservan y posteriormente se utilizan para la infección de células Sf9 frescas. Otra ventaja es el aumento de la estabilidad del baculovirus (VB) en las células Sf9 después de la criopreservación10,11.
Se generan dos tipos de células TIPS para permitir la producción de AAV: la primera por infección de células Sf9 con el gen BV-AAV2-GFP o terapéutico, y la segunda por infección de células Sf9 con BV-AAV2-rep-cap. Las células TIPS se criopreservan en alícuotas pequeñas y listas para usar. Los vectores AAV se producen en cultivo de suspensión sin suero en un matraz colocado en un agitador orbital o biorreactor de onda mediante el cultivo conjunto de células TIPS que producen baculovirus y células Sf9 frescas. Las células Sf9 están infectadas por baculovirus que transportan el vector AAV2-GFP y las secuencias rep-cap para generar AAV. Cuatro o cinco días después, cuando los rendimientos de AAV son los más altos, las células productoras se lisan con detergente para liberar las partículas de AAV. El lisado celular se clarifica posteriormente mediante centrifugación y filtración a baja velocidad. Las partículas de AAV se purifican a partir del lisado mediante cromatografía en columna AVB Sepharose. Finalmente, los vectores AAV se concentran utilizando TFF. El protocolo describe la producción de AAV a pequeña escala, útil para la investigación y los estudios preclínicos. Sin embargo, los métodos son escalables y compatibles con la fabricación de vectores AAV de grado clínico para aplicaciones de terapia génica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

Los virus adenoasociados (AAV) son vectores prometedores para aplicaciones de terapia génica. Aquí, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de Spodoptera frugiperda (Sf9) con células Sf9 infectadas con baculovirus (BV)-AAV2-GFP (o gen terapéutico) y BV-AAV2-rep-cap en cultivo de suspensión sin suero. Las células se cultivan en un matraz en un agitador orbital o biorreactor de onda. Para liberar las partículas AAV, las células productoras se lisan en tampón que contiene detergente, que posteriormente se clarifica mediante centrifugación y filtración a baja velocidad. Las partículas AAV se purifican a partir del lisado celular mediante cromatografía de columna AVB Sepharose, que se une a las partículas AAV. Las partículas unidas se lavan con PBS para eliminar los contaminantes y se eluyen de la resina utilizando tampón de citrato de sodio a pH 3.0. El eluido ácido se neutraliza con tampón alcalino Tris-HCl (pH 8.0), se diluye con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se concentra aún más con filtración de flujo tangencial (TFF). El protocolo describe la producción de vectores preclínicos a pequeña escala compatible con la ampliación a la fabricación de AAV de grado clínico a gran escala para aplicaciones de terapia génica humana.

Aquí, se muestran los resultados representativos del desarrollo de procesos para la producción y purificación de vectores AAV utilizando el sistema de células de insectos Sf9. El método incluye el cocultivo de células Sf9 con células TIPS infectadas por baculovirus, la alimentación de las células con medio de crecimiento, la recolección y lisis de las células productoras para liberar las partículas AAV, la clarificación del lisado celular con tratamiento con nucleasa, centrifugación y filtración, purificac...

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Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

En este protocolo, el vector AAV2 se produce mediante el cocultivo de células de insectos Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus (BV)-AAV2-proteína fluorescente verde (GFP) o gen terapéutico y células Sf9 infectadas con BV-AAV2-rep-cap en cultivo en suspensión. Las partículas de AAV se liberan de las células utilizando detergente, se clarifican, se purifican mediante cromatografía de columna de afinidad y se concentran mediante filtración de flujo tangencial.

Desarrollo de Procesos para la Producción y Purificación de Virus Adeno-Asociados (AAV)2 Vector utilizando el Sistema de Cultivo Celular Baculovirus-Insecto

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Este protocolo será útil para los investigadores que quieran desarrollar métodos para la producción y purificación de AAV utilizando el sistema de cultivo celular baculovirus-insecto. La producción de AAV utilizando el sistema de cultivo celular baculovirus-insecto es un método rentable que es fácil de escalar y es compatible con las buenas prácticas de fabricación actuales. Algunas partes del protocolo serán demostradas por Alan Heizer, un asistente de investigación de mi laboratorio.Comience descongelando un vial de células Sf9 e inmediatamente sembrarlas en 15 mililitros de medio de cultivo de células de insectos. Cultive células Sf9 en una incubadora de agitadores orbitales a 125 RPM y 28 grados Celsius en matraces de fondo redondo con una tapa suelta para el intercambio de aire. Propague las células en un matraz de un litro que contenga 200 mililitros de medio para obtener suficientes células para la producción de células TIPS.Agregue 50 mililitros de celdas Sf9 a 2 veces 10 a las celdas de potencia 6 por mililitro en dos matraces. Infectar un matraz de células Sf9 con 0,5 mililitros de baculovirus-AAV2-GFP, y el otro matraz de células con 0,5 mililitros de baculovirus-AAV2-rep-cap. Tres días después, cosecha una pequeña alícuota de células Sf9 infectadas por baculovirus, también conocidas como células TIPS.Tinción de 2 veces 10 a la 5ª potencia de células Sf9 no infectadas e infectadas por baculovirus con 0,5 microgramos de anticuerpo anti-baculovirus gp64 de ratón que contiene un colorante fluorescente en 100 microlitros de tampón de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de lavar las células con PBS para eliminar el anticuerpo, vuelva a suspender las células teñidas en 300 microlitros de PBS que contienen 0,5 albúmina sérica bovina. Analizar la expresión de baculovirus gp64 en células mediante citometría de flujo.Cuando las células son 80 a 90% viables, con un aumento de diámetro, cosechar las células y criopreservar 1 veces 10 a la 7ª célula de potencia en un mililitro de medio de cultivo de insectos, suplantado con 10% de suero bovino fetal y 10% de sulfóxido de dimetilo en un recipiente de congelación lenta a 80 grados centígrados negativos. Al día siguiente, transfiera el tubo que contiene las células TIPS a un congelador de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Cultive y cultive células Sf9 naïve a 2 veces 10 a la 6ª célula de potencia por mililitro a 28 grados Celsius en varios matraces de dos litros que contienen 400 mililitros de medio de cultivo de células de insectos en una incubadora agitadora que se necesita para la producción de virus adenoasociados o AAV.Después de tres o cuatro días, la densidad celular se incrementa hasta 5 a 6 veces 10 a la 6ª celda de potencia por mililitro. Para la producción de AAV en matraces en una incubadora de agitadores orbitales, use una pipeta o una bomba peristáltica para sembrar 400 mililitros de cultivo de Sf9 a 2 veces 10 a las 6ª celdas de potencia por mililitro en un matraz de dos litros, asépticamente. Configure el agitador orbital a 125 RPM y 28 grados centígrados.Descongele un vial de cada célula TIPS de baculovirus-AAV-GFP y baculovirus-AAV-rep-cap. Diluya las células con 20 mililitros de medio de cultivo de insectos y realice un recuento de viabilidad de las células utilizando azul de tripano. Inocular ambas células TIPS en una proporción de 1 a 10.000 en relación con las células Sf9 ingenuas cultivadas en un matraz agitador o biorreactor.En el segundo día, cosechar un mililitro de cultivo de Sf9 asépticamente y teñir con el tinte azul tripano para analizar el recuento de células, la viabilidad y la morfología. En el tercer día, repita los pasos realizados en el segundo día y verifique el estado de la infección por baculovirus después de teñir las células Sf9. En el quinto día, repita los pasos realizados en el segundo día y luego recolecte el medio de cultivo y las células cuando la viabilidad de Sf9 haya disminuido a alrededor del 50% Recoja el sobrenadante y el pellet celular después de girar, y guárdelos a 80 grados centígrados negativos.Una vez que el pellet de célula productora de AAV se descongele, agréguele un tampón de lisis celular y mezcle vigorosamente. Incubar el pellet resuspendido durante 30 minutos a temperatura ambiente para liberar las partículas AAV. Después de la centrifugación, transfiera el lisado celular a un nuevo contenedor.Mezcle el lisado celular y el sobrenadante de cultivo celular después de la descongelación. Agregue 20 unidades por mililitro de nucleasa y cloruro de magnesio 10 milimolar al lisado celular para digerir el ADN y el ARN, e incube durante dos a cuatro horas a 37 grados centígrados. Filtre el lisado a través de un sistema de doble filtración de polietersulfona de 0,8 micrómetros y 0,2 micrómetros utilizando una bomba.Guarde el lisado celular clarificado a cuatro grados Centígrados durante la noche o purifique el AAV inmediatamente. Monte una columna AVB Sepharose de 10 mililitros en la máquina de cromatografía e inserte la tubería en la muestra AAV, el búfer de lavado y el tampón de elución. Inserte tubos en las ranuras del colector de fracciones de la máquina de cromatografía para recoger las fracciones de la solución de paso de columna, el tampón de lavado y el tampón de elución que contienen las partículas AAV.Equilibre la columna AVB Sepharose con cinco volúmenes de columna de PBS a una velocidad de flujo de cinco mililitros por minuto. Cargue el lisado de celda filtrada que contiene partículas AAV en la columna de afinidad AVB Sepharose utilizando la máquina de cromatografía equipada con una bomba de muestras. Ejecute la muestra a un caudal de tres mililitros por minuto.Pase PBS a través de la columna a una velocidad de flujo de tres mililitros por minuto hasta que la curva de absorbancia ultravioleta a 280 nanómetros regrese a la línea de base y se vuelva estable. Eluya las partículas AAV de la columna AVB Sepharose con tampón de citrato de sodio 50 milimolar pH 3 a una velocidad de flujo de tres mililitros por minuto. Diluya inmediatamente el sobrenadante AAV con un quinto de volumen de Tris HCl 8.0 de 500 milimolares para neutralizar el tampón de elución ácida que contiene AAV.Esto evita la degradación mediada por pH que podría ocurrir con el tampón de elución de pH 3.0 ácido. Luego diluya el sobrenadante AAV diez veces con PBS, de modo que las partículas de AAV estén en un tampón fisiológico. Almacene un mililitro de cada columna de muestras de recorrido, tampón de lavado y 100 microlitros del sobrenadante AAV eluido para evaluar la presencia de AAV por infección de las células diana.Configure el sistema de filtración de flujo tangencial, equipado con un cartucho de membrana de polietersulfona con un corte de peso molecular de 100 kilodalton para concentrar el AAV. Ejecute 200 mililitros de PBS durante 10 minutos para equilibrar el módulo de filtración de flujo tangencial. Cargue la muestra AAV controlando el flujo de la bomba hasta que la muestra se reduzca al volumen deseado.Diafiltra el retentato con 100 mililitros de PBS. Después de concentrar la muestra de AAV en el volumen deseado, recoja la muestra de AAV, filtre a través de un filtro de polietersulfona de 0,2 micrómetros y alícuota. Luego almacene la muestra de AAV a 80 grados centígrados negativos.La mayoría de las células Sf9 se infectaron con el baculovirus en tres o cuatro días, debido a las múltiples rondas de infección, evidenciadas por la expresión de la glicoproteína gp64 del baculovirus. La mayoría de las células también muestran un aumento en el diámetro. Las células muestran un aumento en el diámetro, el efecto citopático, y alrededor de la mitad de las células mueren en cinco días después de la infección, que son los signos de finalización de la producción de AAV.Se observó un pico de proteína mientras se eluía con un tampón ácido correspondiente a la fracción AAV. Las muestras de AAV purificadas muestran tres proteínas de cápside distintas: VP1, VP2 y VP3, después de SDS-PAGE y tinción de plata. El paso más crítico es cosechar las células TIPS antes de la criopreservación, cuando la mayoría de las células se infectan con el baculovirus, con un número mínimo de muerte celular.Hemos descrito la producción y purificación del vector AAV del serotipo 2 como modelo aquí. Sin embargo, el protocolo también se puede aplicar para otros serotipos AAV.

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