Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Vi vill tacka Dr. Robert M. Kotin (National Heart, Blood and Lung Institute, NIH) för att generöst ge oss AAV-plasmiderna och Danielle Steele och Rebecca Ernst (Cincinnati Children's Hospital) för deras tekniska hjälp. Detta arbete stöds av startfonden från Cincinnati Children's Research Foundation till M.N.

Se bild 1 för en illustration som sammanfattar protokollet.
1. Generering av baculovirusinfekterade TIPS-celler
<ol><li>Tina en flaska Sf9-celler och omedelbart så dem i 50 ml insektscellsodlingsmedium. Odla Sf9-celler i en orbital shakerinkubator vid 125 varv/min och 28 °C i rundbottenkolvar med ett löst fäst lock för utbyte av luft8,9. Sprid cellerna i en 1 L-kolv som innehåller 200 ml medium f?...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

De parametrar som används i detta protokoll för processutveckling av produktion, rening och koncentration av AAV-vektorer kan tillämpas på både liten och storskalig tillverkning av AAV-vektorer för genterapiapplikationer. Hela processen uppströms och nedströms kan utföras i ett slutet system som är kompatibelt med den nuvarande goda tillverkningsseden (cGMP). De stora fördelarna med Sf9-baculovirussystemet är skalbarhet för storskalig AAV-produktion av GMP-klass till en överkomlig kostnad. Systemet behöver...

Adenoassocierade virus (AAV) är icke-höljen mänskliga parvovirus som innehåller ett enda strandat DNA på 4,6 kb. AAV-vektorer har flera fördelar jämfört med andra virusvektorer för genterapiapplikationer1,2,3,4. AAV:er är naturligt replikerings inkompetenta och kräver därför ett hjälpvirus och värdmaskiner för replikering. AAV orsakar ingen sjukdom och har låg immunogenicitet i den infekterade värden3,5. AAV kan infektera både quiescent och aktivt dela celler och kan kvarstå som episome utan att integreras i genomet av värdcellerna (AAV integreras sällan i värdgenomet)1,3. Dessa funktioner har gjort AAV till ett önskvärt verktyg för genterapiapplikationer.
För att generera en AAV genöverföring vektor klonas transgenekassetten, inklusive den terapeutiska genen, mellan två interna terminalrepetitioner (ITR), som vanligtvis härrör från AAV serotyp 2. Den maximala storleken från 5' ITR till 3' ITR, inklusive transgenesekvensen, är 4,6 kb6. Olika kapsider kan ha en annan cell eller vävnad tropism. Därför bör kapsider väljas baserat på den vävnad eller celltyp som är avsedd att riktas mot AAV-vektorn7.
Rekombinanta AAV-vektorer produceras ofta i däggdjurs cellinjer såsom mänskliga embryonala njurceller, HEK293 genom övergående transfektion av AAV-genöverföringsvektorn, AAV rep-cap och helpervirusplasmider2,3. Det finns dock flera begränsningar för storskalig AAV-produktion genom transient transfektion av vidhäftande HEK293-celler. För det första behövs ett stort antal cellstackar eller rullflaskor. För det andra behövs högkvalitativt plasmid-DNA och transfektreagenser, vilket ökar tillverkningskostnaderna. Slutligen, när man använder vidhäftande HEK293-celler, behövs serumet ofta för optimal produktion, vilket komplicerar nedströmsbearbetning1,2,3. En alternativ metod för AAV-tillverkning innebär användning av insektscelllinjen, Spodoptera frugiperda (Sf9) celler och ett insektsvirus som kallas rekombinant Autographa californica multicapsid nukleär polyhedrosvirus (AcMNPV eller baculovirus)8,9,10. Sf9-celler odlas i serumfri suspensionskultur som är lätt att skala upp och är kompatibel med nuvarande god tillverkningssed (cGMP) produktion i stor skala, vilket inte kräver plasmid- eller transfektreagenser. Dessutom är kostnaden för AAV-produktionen med hjälp av Sf9-baculovirussystemet lägre än kostnaden för att använda transient transfektion av plasmider till HEK293-celler11.
Det ursprungliga rAAV-produktionssystemet med baculovirus-Sf9-celler använde tre baculovirus: ett baculovirus som innehåller genöverföringskassett, det andra baculoviruset som innehåller repgenen och det tredje baculoviruset som innehåller serotypspecifik kapsidgen12,13. Baculoviruset som innehåller rep konstruktion var dock genetiskt instabila på flera rundor av passager, vilket förhindrade förstärkning av baculovirus för storskalig AAV produktion. För att lösa detta problem utvecklades ett nytt rAAV-vektorsystem, som innehöll två baculovirus (TwoBac): ett baculovirus som innehåller AAV-genöverföringskasetten och ett annat baculovirus som innehåller AAV rep-cap gener tillsammans som är genetiskt stabilare än det ursprungliga systemet och bekvämare att producera rAAV på grund av att använda TwoBac istället för tre14, 15. OneBac-systemet använder AAV-genöverföringskassetten och rep-cap-generna i ett enda baculovirus som är bekvämare att producera rAAV på grund av att använda ett baculovirus istället för att använda TwoBac eller ThreeBac2,16,17. I vår studie användes TwoBac-systemet för optimering.
Baculovirussystemet för AAV-produktion har också begränsningar: baculoviruspartiklar är instabila för långvarig lagring i serumfritt medium11, och om baculovirustitern är låg behövs en stor volym baculovirus supernatant, vilket kan bli giftigt för tillväxten av Sf9-celler under AAV-produktion (personlig observation). Användningen av titerfria infekterade cellkonserverings- och uppskalningsceller (TIPS), eller baculovirusinfekterade insektsceller (BIIC), ger ett bra alternativ för AAV-produktion där baculovirusinfekterade Sf9-celler bereds, kryopreserveras och därefter används för infektion av färska Sf9-celler. En annan fördel är den ökade stabiliteten hos baculovirus (BV) i Sf9-celler efter kryopreservation10,11.
Två typer av TIPS-celler genereras för att möjliggöra AAV-produktion: den första genom infektion av Sf9-celler med BV-AAV2-GFP eller terapeutisk gen, och den andra genom infektion av Sf9-cellen med BV-AAV2-rep-cap. TIPS-celler är kryopreserverade i små och färdiga alikvoter. AAV-vektorer produceras i serumfri suspensionskultur i en kolv placerad i en orbital shaker eller Wave bioreaktor genom att samkultera TIPS-celler som producerar baculovirus och färska Sf9-celler. Sf9-celler infekteras av baculovirus som bär AAV2-GFP-vektorn och rep-cap-sekvenserna för att generera AAV. Fyra till fem dagar senare, när AAV-avkastningen är den högsta, är producentcellerna lysda med tvättmedel för att frigöra AAV-partiklarna. Cell lysate förtydligas därefter genom låg hastighet centrifugering och filtrering. AAV-partiklar renas från lysat av AVB Sepharose kolonnkromatografi. Slutligen koncentreras AAV-vektorer med TFF. Protokollet beskriver produktionen av AAV i liten skala, användbar för forskning och prekliniska studier. Metoderna är dock skalbara och kompatibla med tillverkning av kliniska AAV-vektorer för genterapiapplikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

Adeno-associerade virus (AAV) är lovande vektorer för genterapi applikationer. Här produceras AAV2 vektorn genom samkultur av Spodoptera frugiperda (Sf9) celler med Sf9 celler infekterade med baculovirus (BV)-AAV2-GFP (eller terapeutisk gen) och BV-AAV2-rep-cap i serumfri suspension kultur. Cellerna odlas i en kolv i en orbital shaker eller Wave bioreaktor. För att frigöra AAV-partiklarna lyses producentcellerna i buffertinnehållande tvättmedel, vilket därefter förtydligas genom centrifugering och filtrering med låg hastighet. AAV-partiklar renas från cellen lysate med hjälp av AVB Sepharose kolonnkromatografi, som binder AAV-partiklar. Bundna partiklar tvättas med PBS för att avlägsna föroreningar och eliseras från hartset med natriumcitratbuffert vid pH 3.0. Det sura eluat neutraliseras med alkalisk Tris-HCl-buffert (pH 8.0), späds ut med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och koncentreras ytterligare med tangentiell flödesfiltrering (TFF). Protokollet beskriver småskalig preklinisk vektorproduktion kompatibel med uppskalning till storskalig klinisk kvalitet AAV tillverkning för mänskliga genterapi applikationer.

Här visas de representativa resultaten av processutveckling för produktion och rening av AAV-vektorer med hjälp av Sf9 insektscellsystemet. Metoden inkluderar samkultur av Sf9-celler med baculovirusinfekterade TIPS-celler, utfodring av cellerna med tillväxtmedium, skörd och lys av producentcellerna för att frigöra AAV-partiklarna, förtydligande av celllyte med nukleasbehandling, centrifugering och filtrering, rening av AAV med av AVB Sepharose affinitetskromatografi och koncentration med TFF (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

I detta protokoll produceras AAV2 vektor genom samodling Spodoptera frugiperda (Sf9) insektsceller med baculovirus (BV)-AAV2-grönt fluorescerande protein (GFP) eller terapeutisk gen och BV-AAV2-rep-cap infekterade Sf9 celler i suspension kultur. AAV-partiklar frigörs från cellerna med tvättmedel, förtydligas, renas genom affinitetskolonnkromatografi och koncentreras genom tangentiell flödesfiltrering.

Processutveckling för produktion och rening av Adeno-associerat virus (AAV)2 Vektor med baculovirus-insektscellskultursystem

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Detta protokoll kommer att vara användbart för de utredare som vill utveckla metoder för AAV-produktion och rening med hjälp av baculovirus-insektscellsodlingssystemet. AAV-produktion med hjälp av baculovirus-insektscellsodlingssystem är en kostnadseffektiv metod som är lätt att skala upp och är kompatibel med nuvarande goda tillverkningssed. Vissa delar av protokollet kommer att demonstreras av Alan Heizer, en forskningsassistent vid mitt laboratorium.Börja med att tina en flaska Sf9-celler och omedelbart så dem i 15 milliliter insektscellsodlingsmedium. Odla Sf9-celler i en orbital shakerinkubator vid 125 RPM och 28 grader Celsius i rundbottnade flaskor med ett löst fäst lock för utbyte av luft. Sprid cellerna i en enliterskolv som innehåller 200 milliliter medium för att få tillräckligt med celler för TIPS-cellproduktion.Tillsätt 50 milliliter Sf9-celler vid 2 gånger 10 till de 6: e kraftcellerna per milliliter i två flaskor. Infektera en kolv Sf9-celler med 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-GFP och den andra cellkolven med 0,5 milliliter baculovirus-AAV2-rep-cap. Tre dagar senare skörda en liten alikvot av baculovirus-infekterade Sf9-celler, även kända som TIPS-celler.Fläcka 2 gånger 10 till den 5: e kraften hos både oinfekterade och baculovirusinfekterade Sf9-celler med 0,5 mikrogram mus anti-baculovirus gp64 antikropp som innehåller ett fluorescerande färgämne i 100 mikroliter av blockerande buffert i 30 minuter vid omgivningstemperatur i mörkret. Efter att ha tvättat cellerna med PBS för att avlägsna antikroppen, suspendera de färgade cellerna i 300 mikroliter PBS innehållande 0, 5 nötkreatur serumalbumin. Analysera baculovirus gp64-uttrycket på celler med hjälp av flödescytometri.När cellerna är 80 till 90%livskraftiga, med en ökning av diametern, skörda cellerna och kryopreserven 1 gånger 10 till de 7: e kraftcellerna i en milliliter insektsodlingsmedium, ersatt med 10% fetalt bovint serum och 10% dimetylsulfoxid i en långsamt frysande behållare vid negativa 80 grader Celsius. Nästa dag överför du röret som innehåller TIPS-celler till en flytande kvävefrys för långtidsförvaring. Odla och odla naiva Sf9-celler vid 2 gånger 10 till den 6: e kraftcellen per milliliter vid 28 grader Celsius i flera tvålitskolvar som innehåller 400 milliliter insektscellsodlingsmedium i en skakinkubator som behövs för adeno-associerade virus eller AAV-produktion.Efter tre till fyra dagar ökas celltätheten till upp till 5 till 6 gånger 10 till de 6: e kraftcellerna per milliliter. För AAV-produktion i flaskor i en orbital shakerinkubator, använd en pipett eller en peristaltisk pump för att så 400 milliliter Sf9-odling till 2 gånger 10 till 6: e kraftceller per milliliter till en tvåliterskolv, aseptiskt. Ställ in orbital shaker vid 125 RPM och 28 grader Celsius.Tina en flaska av varje baculovirus-AAV-GFP och baculovirus-AAV-rep-cap TIPS celler. Späd cellerna med 20 milliliter insektsodlingsmedium och utför ett livskraftantal av cellerna med trypanblått. Inokulera båda TIPS-cellerna i ett förhållande av 1 till 10 000 i förhållande till de naiva Sf9-celler som odlas i en shakerkolv eller bioreaktor.På dag två, skörda en milliliter av Sf9 kultur aseptically, och fläcka med trypan blå färgämnet för att analysera cellantal, livskraft och morfologi. På dag tre upprepar du stegen som utförs på dag två och kontrollera statusen för baculovirusinfektionen efter färgning av Sf9-cellerna. På dag fem, upprepa stegen som utförs på den andra dagen och skörda sedan odlingsmediet och cellerna när Sf9-livskraften har minskat till cirka 50%Samla supernatanten och cellpelleten efter spinning och lagra dem på negativa 80 grader Celsius.När AAV-producentens cellpellet tinas, tillsätt celllysbuffert till den och blanda kraftigt. Inkubera den igen suspenderade pelleten i 30 minuter vid omgivningstemperatur för att frigöra AAV-partiklarna. Efter centrifugering överför du cellens lysate till en ny behållare.Blanda celllyte och cellkultur supernatant efter upptining. Tillsätt 20 enheter per milliliter nukleas och 10-millimolar magnesiumklorid till celllylystern för att smälta DNA och RNA och inkubera i två till fyra timmar vid 37 grader Celsius. Filtrera lysat genom ett 0,8 mikrometer och 0,2 mikrometer polyetersulfonsystem med hjälp av en pump.Förvara den klarnade cell lysat vid fyra grader Celsius över natten, eller rena AAV omedelbart. Montera en 10-milliliter AVB Sepharose-kolonn på kromatografimaskinen och sätt in rörledningen i AAV-provet, tvättbufferten och elutionsbufferten. Sätt in rör i fraktionsuppsamlarspåren i kromatografimaskinen för att samla in fraktionerna av kolonngenomströmningslösning, tvättbuffert och elutionsbuffert som innehåller AAV-partiklarna.Balansera AVB Sepharose-kolonnen med fem kolonnvolymer PBS med en flödeshastighet på fem milliliter per minut. Ladda den filtrerade cell lysat som innehåller AAV-partiklar på AVB Sepharose affinitetskolonn med hjälp av kromatografimaskinen utrustad med en provpump. Kör provet med en flödeshastighet på tre milliliter per minut.Kör PBS genom kolonnen med en flödeshastighet på tre milliliter per minut tills den ultravioletta absorbanskurvan vid 280 nanometer återgår till baslinjen och blir stabil. Elute AAV partiklarna från AVB Sepharose kolonnen med 50-millimolar natriumcitrat buffert pH 3 med en flödeshastighet på tre milliliter per minut. Späd omedelbart ut AAV-supernatanten med en femtedels volym 500 millimoler Tris HCl pH 8,0 för att neutralisera den sura elutionsbufferten som innehåller AAV.Detta förhindrar den pH-medierade nedbrytning som kan uppstå med surt pH 3,0 elutionsbuffert. Späd sedan ut AAV-supernatanten tiofaldigt med PBS, så att AAV-partiklarna är i en fysiologisk buffert. Förvara en milliliter av varje kolonn genomgående prover, tvättbuffert och 100 mikroliter av den eltuterade AAV-supernatanten för att utvärdera förekomsten av AAV genom infektion i målcellerna.Ställ in tangentiellt flödesfiltreringssystem, utrustat med en polyetersulfonmembranpatron med en 100-kilodalton molekylviktsavstängning för att koncentrera AAV. Kör 200 milliliter PBS i 10 minuter för att balansera tangentiell flödesfiltreringsmodul. Ladda AAV-provet genom att styra pumpens flöde tills provet reduceras till önskad volym.Diafiltrera retentatet med 100 milliliter PBS. När AAV-provet har koncentrerats till önskad volym samlar du upp AAV-provet, filtrerar det genom ett 0,2 mikrometer polyetersulfonfilter och alikvoterar det. Förvara sedan AAV-provet på minus 80 grader Celsius.De flesta av Sf9 cellerna blev smittade med baculovirus i tre till fyra dagar, på grund av att flera omgångar av infektion, framgår av baculovirus glykoprotein gp64 uttryck. De flesta av cellerna visar också en ökning av diametern. Cellerna visar en ökning av diameter, cytopatisk effekt, och ungefär hälften av cellerna dör i fem dagar efter infektion, vilket är tecken på slutförande av AAV-produktionen.En topp av protein sågs medan elution med en sur buffert motsvarande AAV fraktionen. De renade AAV-proverna visar tre distinkta kapsidproteiner: VP1, VP2 och VP3, efter SDS-PAGE och silverfärgning. Det mest kritiska steget är att skörda TIPS-cellerna före kryopreservation, när de flesta cellerna blir infekterade med baculoviruset, med ett minsta antal celldöd.Vi har beskrivit produktion och rening av AAV vektor av serotyp 2 som en modell här. Protokollet kan dock också tillämpas för andra AAV-serotyper.

Research

JoVE Journal

Biology

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Metoden för Gnagare Hela Embryo Culture med Rotator-typ System Bottle Kultur

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Slutet system Cell Culture protokoll Använda HyperStack Fartyg med gas genomsläppligt material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Den MultiBac Protein Complex Production Platform vid EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Den Slice Kultur Metod för att följa utveckling av Tand bakterier i Explantation kultur

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Ett<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur systemet studerar Thyroid Utveckling

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Utveckling av en in Co-kultur system av två Cellular typer i frånvaro av cell-cellkontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fett kroppen kultur organsystem i Aedes Aegypti, en vektor av zikaviruset

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

En kvantitativ Dot Blot analys för AAV titrering och dess användning för funktionell bedömning av den Adeno-associerade Virus församling-aktiverande protein

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Detektering av virus- och salivproteiner från en bladhoppvektor i växtvärden

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

Generering av bruna fettspecifika knockoutmöss med hjälp av ett kombinerat Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- och adenoassocierat virus med en guide RNA-system

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...