Name: process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system
Uploaded: 2022-01-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Dr. Robert M. Kotin'e (Ulusal Kalp, Kan ve Akciğer Enstitüsü, NIH) bize cömertçe AAV plazmidlerini ve Danielle Steele ve Rebecca Ernst'e (Cincinnati Çocuk Hastanesi) teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı'ndan M.N.'ye start-up fonu tarafından desteklenmektedir.

Protokolü özetleyen bir çizim için Şekil 1'e bakın.
1. Baculovirüs ile enfekte TIPS hücrelerinin üretimi
<ol><li>Bir şişe Sf9 hücresini çözün ve hemen 50 mL böcek hücre kültürü ortamında tohumlayın. Sf9 hücrelerini 125 rpm'de bir orbital çalkalayıcı inkübatörde ve 28 °C'de, hava değişimi için gevşek bir şekilde tutturulmuş bir kapakla yuvarlak alt şişelerde büyütün8,9</s...

<ol>
	<li>Hildinger, M., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+AAV-mediated+gene+transfer+for+the+treatment+of+inherited+disorders.">Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders.</a> European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).</li><li>Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+serotypes:+vector+toolkit+for+human+gene+therapy.">Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy.</a> Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).</li><li>Nathwani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-associated+virus+vector-mediated+gene+transfer+in+hemophilia+B.">Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).</li><li>Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+vector+as+a+platform+for+gene+therapy+delivery.">Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).</li><li>Mingozzi, F., High, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+AAV+vectors:+overcoming+barriers+to+successful+gene+therapy.">Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy.</a> Blood. 122 (1), 23-36 (2013).</li><li>Grieger, J. C., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+capacity+of+adeno-associated+virus+serotypes:+impact+of+larger+genomes+on+infectivity+and+postentry+steps.">Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps.</a> Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-dressing+the+virion:+the+transcapsidation+of+adeno-associated+virus+serotypes+functionally+defines+subgroups.">Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups.</a> Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).</li><li>Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+baculovirus+vectors+using+heparin+affinity+chromatography.">Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 3, 16071 (2016).</li><li>Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+Purification+of+Baculovirus+for+Gene+Therapy+Application.">Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).</li><li>Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Production+Using+Baculovirus+Expression+Vector+System.">AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System.</a> Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).</li><li>Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+high+yields+of+recombinant+adeno-associated+virus+produced+using+invertebrate+cells+in+0.02-+to+200-liter+cultures.">Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures.</a> Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).</li><li>Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+cells+as+a+factory+to+produce+adeno-associated+virus+type+2+vectors.">Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors.</a> Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).</li><li>Urabe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+generation+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+type+5+in+insect+cells.">Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells.</a> Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intron+splicing-mediated+expression+of+AAV+Rep+and+Cap+genes+and+production+of+AAV+vectors+in+insect+cells.">Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells.</a> Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).</li><li>Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatography-based+purification+of+adeno-associated+virus.">Chromatography-based purification of adeno-associated virus.</a> Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).</li><li>Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+system+for+highly+efficient+production+of+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+vectors+in+insect+Sf9+cells.">An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Popularizing+recombinant+baculovirus-derived+OneBac+system+for+laboratory+production+of+all+recombinant+adeno-associated+virus+vector+serotypes.">Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes.</a> Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).</li><li>Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moving+from+the+bench+towards+a+large+scale,+industrial+platform+process+for+adeno-associated+viral+vector+purification.">Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).</li><li>Joshi, P. R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+scalable+and+robust+AEX+method+for+enriched+rAAV+preparations+in+genome-containing+VCs+of+serotypes+5,+6,+8,+and+9.">Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 341-356 (2021).</li><li>Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separating+empty+and+full+recombinant+adeno-associated+virus+particles+using+isocratic+anion+exchange+chromatography.">Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography.</a> Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).</li><li>Wright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manufacturing+and+characterizing+AAV-based+vectors+for+use+in+clinical+studies.">Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies.</a> Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).</li><li>Tomono, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=highly+efficient+ultracentrifugation-free+chromatographic+purification+of+recombinant+AAV+serotype+9.">highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 11, 180-190 (2018).</li></ol>

AAV vektörlerinin üretim, saflaştırma ve konsantrasyonunun proses geliştirilmesi için bu protokolde kullanılan parametreler, gen tedavisi uygulamaları için AAV vektörlerinin hem küçük hem de büyük ölçekli üretimine uygulanabilir. Tüm yukarı ve aşağı akış işlemi, mevcut İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) ile uyumlu kapalı bir sistemde gerçekleştirilebilir. Sf9-baculovirüs sisteminin en büyük avantajları, uygun maliyetle büyük ölçekli GMP sınıfı AAV üretimi için ölçeklenebilirlikt...

Adeno ilişkili virüsler (AAV), 4,6 kb'lık tek iplikli DNA içeren zarfsız insan parvovirüsleridir. AAV vektörleri gen tedavisi uygulamaları için diğer viral vektörlere göre çeşitli avantajlara sahiptir1,2,3,4. AAV'ler doğal olarak çoğaltma yetersizdir, böylece çoğaltma için yardımcı bir virüs ve ana bilgisayar makineleri gerektirir. AAV'ler herhangi bir hastalığa neden olmaz ve enfekte konakta düşük immünojenikliğe sahiptir3,5. AAV hem sessiz hem de aktif olarak bölünen hücreleri enfekte edebilir ve konak hücrelerin genomuna entegre olmadan epizom olarak devam edebilir (AAV nadiren konak genomuna entegre olur)1,3. Bu özellikler AAV'ı gen tedavisi uygulamaları için arzu edilen bir araç haline getirmiştir.
Bir AAV gen transfer vektörü oluşturmak için, terapötik gen de dahil olmak üzere transgene kaseti, tipik olarak AAV serotip 2'den türetilen iki iç terminal tekrarı (ITR) arasında klonlanır. Transgene dizisi de dahil olmak üzere 5' ITR'den 3' ITR'ye kadar olan maksimum boyut 4,6 kb6 'dır. Farklı kapsidler farklı bir hücre veya doku tromizmine sahip olabilir. Bu nedenle, AAV vektörü ile hedef alınması amaçlanan doku veya hücre tipine göre kapsidler seçilmelidir7.
Rekombinant AAV vektörleri genellikle insan embriyonik böbrek hücreleri, HEK293 gibi memeli hücre hatlarında AAV gen transfer vektörü, AAV rep-cap ve yardımcı virüs plazmidleri2,3transeksiyon ile üretilir. Bununla birlikte, yapışan HEK293 hücrelerinin geçici transfeksiyon yoluyla büyük ölçekli AAV üretimi için çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, çok sayıda hücre yığınına veya makaralı şişeye ihtiyaç vardır. İkinci olarak, yüksek kaliteli plazmid DNA ve transfeksiyon reaktiflerine ihtiyaç vardır ve bu da üretim maliyetini arttırır. Son olarak, yapışık HEK293 hücreleri kullanılırken, serum sıklıkla en uygun üretim için gereklidir, aşağı akışişlemeyizorlaştırır 1,2,3. AAV üretiminin alternatif bir yöntemi, böcek hücre hattının, Spodoptera frugiperda (Sf9) hücrelerinin ve rekombinant Autographa californica multicapsid nükleer polihedroz virüsü (AcMNPV veya baculovirus) 8,9,10adı verilen bir böcek virüsünün kullanılmasını içerir. Sf9 hücreleri, ölçeğini büyütmesi kolay ve plazmid veya transfeksiyon reaktifleri gerektirmeyen büyük ölçekte mevcut iyi üretim uygulaması (cGMP) üretimiyle uyumlu serumsuz süspansiyon kültüründe yetiştirilir. Ayrıca, Sf9-baculovirüs sistemini kullanan AAV üretiminin maliyeti, plazmidlerin HEK293 hücrelerine geçici transfeksiyonunun kullanılması maliyetinden daha düşüktür11.
Baculovirus-Sf9 hücrelerinin kullanıldığı orijinal rAAV üretim sistemi üç baculovirüs kullandı: gen transfer kaseti içeren bir baculovirüs, rep geni içeren ikinci baculovirüs ve serotipe özgü kapsid geni içeren üçüncü baculovirüs12,13. Bununla birlikte, rep yapısı içeren baculovirüs, büyük ölçekli AAV üretimi için baculovirüsun amplifikasyonuna engel olan birden fazla geçiş turunda genetik olarak kararsızdı. Bu sorunu çözmek için, iki baculovirüs (TwoBac) içeren yeni bir rAAV vektör sistemi geliştirildi: AAV gen transfer kasetini içeren bir baculovirüs ve AAV rep-cap genlerini içeren başka bir baculovirüs, genetik olarak orijinal sistemden daha kararlı ve üç14yerine TwoBac kullandığı için rAAV üretmek için daha uygunolan , 15. OneBac sistemi, TwoBac veya ThreeBac 2,16,17kullanmak yerine bir baculovirüs kullanmak nedeniyle rAAV'ı üretmekiçin daha uygun olan tek bir baculovirüste AAV gen transfer kasetini ve rep-cap genlerini kullanır. Çalışmamızda, TwoBac sistemi optimizasyon için kullanılmıştır.
AAV üretimi için baculovirüs sisteminin de sınırlamaları vardır: baculovirüs parçacıkları serumsuz orta11'deuzun süreli depolama için kararsızdır ve baculovirüs titresi düşükse, AAV üretimi sırasında Sf9 hücrelerinin büyümesi için toksik hale gelebilecek büyük miktarda baculovirüs supernatant'a ihtiyaç vardır (kişisel gözlem). Titersiz enfekte hücre koruma ve ölçek büyütme (TIPS) hücrelerinin veya baculovirüs bulaşmış böcek hücrelerinin (BIIC) kullanılması, baculovirüs bulaşmış Sf9 hücrelerinin hazırlandığı, kriyoprezervasyona edildiği ve daha sonra taze Sf9 hücrelerinin enfeksiyonu için kullanıldığı AAV üretimi için iyi bir seçenek sağlar. Bir diğer avantaj, kriyoprezervasyon10 , 11'densonra Sf9 hücrelerinde baculovirüs (BV)stabilitesininartmasıdır.
AAV üretimini sağlamak için iki tip TIPS hücresi üretilir: birincisi Sf9 hücrelerinin BV-AAV2-GFP veya terapötik gen ile enfeksiyonu ve ikincisi BV-AAV2-rep-cap ile Sf9 hücresinin enfeksiyonu ile. TIPS hücreleri küçük ve kullanıma hazır aliquotlarda kriyoprezot olarak saklanır. AAV vektörleri, baculovirüsler ve taze Sf9 hücreleri üreten TIPS hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla yörüngesel çalkalayıcıya veya Dalga biyoreaktörüne yerleştirilen bir şişede serumsuz süspansiyon kültüründe üretilir. Sf9 hücreleri, AAV2-GFP vektörünü taşıyan baculovirüsler ve AAV oluşturmak için rep-cap dizileri ile enfekte olur. Dört ila beş gün sonra, AAV verimi en yüksek olduğunda, üretici hücreler AAV parçacıklarını serbest bırakmak için deterjanla yutlanır. Hücre lysate daha sonra düşük hızlı santrifüjleme ve filtrasyon ile netleştirilir. AAV parçacıkları AVB Sepharose kolon kromatografisi ile lysattan arındırılır. Son olarak, AAV vektörleri TFF kullanılarak yoğunlaşmıştır. Protokol, AAV'nin araştırma ve klinik öncesi çalışmalar için yararlı olan küçük ölçekte üretimini tanımlamaktadır. Bununla birlikte, yöntemler ölçeklenebilir ve gen tedavisi uygulamaları için klinik sınıf AAV vektörleri üretimi ile uyumludur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1 N Sodium Hydroxide</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >1.09137</td>
			<td >For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 L flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>431281</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml Conical tube</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14-959-49A</td>
			<td>For collection of supernatants</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >24-well plate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>07-200-80</td>
			<td>Adherent cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >250 mL flasks</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>238071</td>
			<td>Flask for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Akta Avant 150 with Unicorn Software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28976337</td>
			<td>Chromatography system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AVB Sepharose High Performance</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28411210</td>
			<td>Chromatography medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 GFP</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV transfer vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Baculovirus-AAV-2 rep-cap</td>
			<td>In-house</td>
			<td>non-catalog</td>
			<td>AAV packaging vector</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1014</td>
			<td>Enzyme to degrade DNA and RNA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blocking buffer</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>516214</td>
			<td>Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cell lysis buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cellbag, 2 L and 10 L</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28937662</td>
			<td>Bioreactor bag</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cleaning buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>100 mM citric acid (pH 2.1)&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryovial</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1222C24</td>
			<td>For cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429</td>
			<td>Growth media for cell lines</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Elution buffer</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7073</td>
			<td>For disinfection and storage of the chromatography</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filtration unit&#160;</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>12941</td>
			<td>Membrane filter</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT1080 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td >CCL-121</td>
			<td>Fibroblast cell line</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HyClone&#8482; SFX-Insect culture media</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30278.02</td>
			<td>Serum-free insect cell growth medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Peristaltic Pump</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>TFF pump</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MaxQ 8000 orbital shaker incubator&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Shaker for suspension culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>Cell monitoring and counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnologies</td>
			<td>65498 PE</td>
			<td>Monitoring baculovirus infection in Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Oxygen tank</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td >20012027</td>
			<td>Wash buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Silver Staining kit</td>
			<td >ThermoFisher Scientific</td>
			<td >LC6100</td>
			<td >Staining AAV capsid proteins</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sf9 cells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11496-015</td>
			<td>Insect cells</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Steile water</td>
			<td>In-house</td>
			<td>Non-catalog item</td>
			<td>For Akta Avant cleaning</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Table top centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>75253839/433607</td>
			<td>For clarification of Baculovirus supernatant</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tangential Flow Filtration (TFF) cartridge</td>
			<td>Pall Corporation</td>
			<td>OA100C12</td>
			<td>TFF cartridge to concentrate the AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-HCl, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td>Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >WAVE Bioreactor System 20/50</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>28-9378-00</td>
			<td>Bioreactor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process development for the production and purification of adeno-associated virus (aav)2 vector using baculovirus-insect cell culture system

Adeno ilişkili virüsler (AAV) gen tedavisi uygulamaları için umut verici vektörlerdir. Burada, AAV2 vektörü, serumsuz süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-GFP (veya terapötik gen) ve BV-AAV2-rep-cap ile enfekte olmuş Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) hücrelerinin ortak kültürü tarafından üretilir. Hücreler bir yörünge çalkalayıcı veya Dalga biyoreaktöründe bir şişede kültürlenir. AAV parçacıklarını serbest bırakmak için, üretici hücreler deterjan içeren tamponda lislenir ve daha sonra düşük hızlı santrifüjleme ve filtrasyon ile netleştirilir. AAV parçacıkları, AAV parçacıklarını bağlayan AVB Sepharose sütun kromatografisi kullanılarak hücre lisattan arındırılır. Bağlı parçacıklar, kirleticileri gidermek için PBS ile yıkanır ve pH 3.0'da sodyum sitrat tamponu kullanılarak reçineden elde edilir. Asidik elüat alkali Tris-HCl tamponu (pH 8.0) ile nötralize edilir, fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir ve teğetsel akış filtrasyonu (TFF) ile daha da yoğunlaşır. Protokol, insan gen terapisi uygulamaları için büyük ölçekli klinik sınıf AAV üretimine kadar ölçekleme ile uyumlu küçük ölçekli klinik öncesi vektör üretimini tanımlamaktadır.

Burada, Sf9 böcek hücre sistemi kullanılarak AAV vektörlerinin üretimi ve saflaştırılması için proses gelişiminin temsili sonuçları gösterilmiştir. Yöntem, Sf9 hücrelerinin baculovirüs ile enfekte TIPS hücreleri ile birlikte kültürlenmesini, hücrelerin büyüme ortamı ile beslenmesini, AAV parçacıklarını serbest bırakmak için üretici hücrelerin toplanmasını ve lizizlenmesini, hücre lizatının nükleaz tedavisi ile netleştirilmesini, santrifüjlenme ve filtrasyonunu, AVB Sepharose benze...

Watch this Scientific Journal Video about Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System at JoVE.com

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Bu protokolde AAV2 vektörü, süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-yeşil floresan protein (GFP) veya terapötik gen ve BV-AAV2-rep-cap enfekte Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla üretilmektedir. AAV parçacıkları deterjan kullanılarak hücrelerden salınır, netleştirilir, benzeşim kolonu kromatografisi ile saflaştırılır ve teğetsel akış filtrasyonu ile konsantre edilir.

Baculovirus-Insect Hücre Kültürü Sistemi Kullanılarak Adeno-İlişkili Virüsün (AAV)2 Vektörün Üretimi ve Saflaştırılması için Süreç Geliştirme

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera ...

Bu protokol, baculovirüs-böcek hücre kültürü sistemini kullanarak AAV üretimi ve saflaştırılması için yöntemler geliştirmek isteyen araştırmacılar için yararlı olacaktır. Baculovirüs-böcek hücre kültürü sistemi kullanılarak AAV üretimi, ölçeğinin büyütülması kolay ve mevcut iyi üretim uygulamasıyla uyumlu, uygun maliyetli bir yöntemdir. Protokolün bazı bölümleri laboratuvarımın araştırma asistanı Alan Heizer tarafından gösterilecek.Bir şişe Sf9 hücresini çözerek başlayın ve hemen 15 mililitre böcek hücresi kültürü ortamına tohumlayın. Sf9 hücrelerini 125 RPM'de bir orbital çalkalayıcı inkübatörde ve 28 santigrat derece yuvarlak tabanlı şişelerde, hava değişimi için gevşek bir şekilde tutturulmuş bir kapakla büyütün. TIPS hücre üretimi için yeterli hücre elde etmek için hücreleri 200 mililitre orta içeren bir litrelik bir şişeye yayın.mililitre başına 6. güç hücrelerine iki şişede 2 kez 10'da 50 mililitre Sf9 hücresi ekleyin. Sf9 hücrelerinin bir şişesini 0,5 mililitre baculovirüs-AAV2-GFP ile, diğer hücre şişesini ise 0,5 mililitre baculovirüs-AAV2-rep-cap ile enfekte edin. Üç gün sonra, TIPS hücreleri olarak da bilinen baculovirüs bulaşmış Sf9 hücrelerinin küçük bir aliquot'ını hasat edin.Karanlıkta ortam sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 mikrolitre bloke tamponunda floresan boya içeren 0,5 mikrogram fare anti-bakülovirüs gp64 antikoru ile hem enfekte olmayan hem de baculovirüs bulaşmış Sf9 hücrelerinin 5. gücüne 2 kez 10 lekeleyin. Antikoru çıkarmak için hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, 0,5 sığır serum albümini içeren 300 mikrolitre PBS'de lekeli hücreleri yeniden askıya alın. Akış sitometrisi kullanarak hücrelerde baculovirus gp64 ekspresyon analiz edin.Hücreler% 80 ila 90 yaşayabilir olduğunda, çapı arttığında, hücreleri hasat edin ve kriyoprezerserve 1 kez 10 ila 7 inci güç hücrelerini bir mililitre böcek kültürü ortamında, % 10 fetal sığır serumu ve% 10 dimetil süloksit ile desteklenmiş, yavaş donan bir kapta eksi 80 santigrat derecede. Ertesi gün, TIPS hücrelerini içeren tüpü uzun süreli depolama için sıvı bir azot dondurucuya aktarın. Adeno ilişkili virüs veya AAV üretimi için gerekli olan bir çalkalayıcı inkübatörde 400 mililitre böcek hücresi kültürü ortamı içeren birkaç iki litrelik şişelerde mililitre başına 2 kez 10 ila 6.Üç ila dört gün sonra, hücre yoğunluğu mililitre başına 6. Yörüngesel çalkalayıcı inkübatördeki şişelerde AAV üretimi için, 400 mililitre Sf9 kültürünü 2 kez 10 ila 6. Yörüngesel çalkalayıcıyı 125 RPM ve 28 santigrat derecede kurun.Her baculovirüs-AAV-GFP ve baculovirus-AAV-rep-cap TIPS hücrelerinden bir şişe çözün. Hücreleri 20 mililitre böcek kültürü ortamı ile seyreltin ve trippan mavisi kullanarak hücrelerin canlılık sayısını gerçekleştirin. Her iki TIPS hücresini de bir çalkalayıcı şişede veya biyo-reaktörde kültürlenmiş naif Sf9 hücrelerine göre 1 ila 10.000 oranında aşılayın.İkinci gün, bir mililitre Sf9 kültürünü aseptik olarak hasat edin ve hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz etmek için trypan mavi boya ile lekelenin. Üçüncü gün, ikinci günde yapılan adımları tekrarlayın ve Sf9 hücrelerini lekeledikten sonra baculovirüs enfeksiyonunun durumunu kontrol edin. Beşinci günde, ikinci günde gerçekleştirilen adımları tekrarlayın ve ardından Sf9 canlılığı yaklaşık% 50'ye düştüğünde kültür ortamını ve hücrelerini hasat edin Döndükten sonra süpernatantı ve hücre peletini toplayın ve negatif 80 santigrat derecede saklayın.AAV-prodüktör hücre peleti çözüldükten sonra, içine hücre liziz tamponu ekleyin ve kuvvetlice karıştırın. AAV parçacıklarını serbest bırakmak için yeniden askıya alınan peleni ortam sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya bırakın. Santrifüjlemeden sonra, hücre lisatını yeni bir kaba aktarın.Çözdükten sonra hücre lisatını ve hücre kültürü üstnatantını karıştırın. DNA ve RNA'yı sindirmek için mililitre nükleaz başına 20 birim ve hücre lisatine 10 milimoler magnezyum klorür ekleyin ve 37 santigrat derecede iki ila dört saat kuluçkaya yatırın. Bir pompa kullanarak 0,8 mikrometre ve 0,2 mikrometre poliethersülfon çift filtrasyon sistemi ile listi filtreleyin.Netleştirilmiş hücre lisasını bir gecede dört santigrat derecede saklayın veya AAV'yi hemen arındırın. Kromatografi makinesine 10 mililitre avb sepharose sütun monte edin ve boru hattını AAV numunesine, yıkama tamponuna ve elüsyon tamponuna yerleştirin. AAV parçacıklarını içeren sütun geçiş çözeltisi, yıkama tamponu ve elütion tamponunun fraksiyonlarını toplamak için kromatografi makinesinin fraksiyon toplayıcı yuvalarına tüpler yerleştirin.AVB Sepharose sütununu dakikada beş mililitre akış hızında beş sütun pbs hacmi ile dengele. AAV parçacıklarını içeren filtrelenmiş hücre lisatı, örnek bir pompa ile donatılmış kromatografi makinesini kullanarak AVB Sepharose benzeşim sütununa yükleyin. Örneği dakikada üç mililitrelik bir akış hızında çalıştırın.PBS'yi, 280 nanometredeki ultraviyole emiciliği eğrisi taban çizgisine dönene ve kararlı hale gelene kadar dakikada üç mililitrelik bir akış hızında sütun boyunca çalıştırın. AVB Sepharose sütunundaki AAV parçacıklarını dakikada üç mililitre akış hızında 50 milimolar sodyum sitrat tampon pH 3 ile elute edin. AAV'yi içeren asidik elüasyon tamponu nötralize etmek için AAV süpernatantını beşte bir hacme sahip 500 milimolar Tris HCl pH 8.0 ile hemen seyreltin.Bu, asidik pH 3.0 elüasyon tamponu ile oluşabilecek pH aracılı bozulmayı önler. Daha sonra AAV süpernatantını PBS ile on kat seyreltin, böylece AAV parçacıkları fizyolojik bir tampondadır. AAV'nin varlığını hedef hücrelerin enfeksiyonuyla değerlendirmek için her sütundan bir mililitre numune, yıkama tamponu ve 100 mikrolitre eluted AAV süpernatantı depolayın.AAV'yi konsantre etmek için 100 kilodalton moleküler ağırlık kesmeli poliethersülfon membran kartuşu ile donatılmış teğetsel akış filtrasyon sistemini kurun. Teğetsel akış filtrasyon modülunu aşındırmak için 10 dakika boyunca 200 mililitre PBS çalıştırın. Numune istenen hacme inene kadar pompanın akışını kontrol ederek AAV örneğini yükleyin.100 mililitre PBS ile retentate diafiltrate. AAV örneğini istenen hacme konsantre ettikten sonra, AAV örneğini toplayın, 0,2 mikrometre poliethersülfon filtreden filtreleyin ve aliquotlayın. Ardından AAV örneğini eksi 80 santigrat derecede saklayın.Sf9 hücrelerinin çoğu, baculovirüs glikoprotein gp64 ekspresyonu ile kanıtlanan çoklu enfeksiyon turları nedeniyle üç ila dört gün içinde baculovirüs ile enfekte oldu. Hücrelerin çoğu da çapında bir artış gösterir. Hücreler çapında bir artış, sitopatik etki gösterir ve hücrelerin yaklaşık yarısı, AAV üretiminin tamamlanmasının belirtileri olan enfeksiyon sonrası beş gün içinde ölür.AAV fraksiyonuna karşılık gelen asidik bir tampon ile elüsyon yaparken protein zirvesi görüldü. Saflaştırılmış AAV örnekleri üç farklı kapsid proteini gösterir: SDS-PAGE ve gümüş boyamadan sonra VP1, VP2 ve VP3. En kritik adım, hücrelerin çoğu baculovirüs ile enfekte olduğunda, en az sayıda hücre ölümü ile kriyoprezervasyondan önce TIPS hücrelerinin toplanmasıdır.Serotip 2'nin AAV vektörün üretimini ve saflaştırılmasını burada bir model olarak tanımladık. Ancak, protokol diğer AAV serotipleri için de uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Gaz Geçirgen Malzeme Teknolojisi HYPERStack gemiler Kapalı Sistem Hücre Kültürü Protokolü

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL de MultiBac Protein Complex Üretim Platformu

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

Eksplantasyon Kültüründe Diş mikropların Geliştirme takiben için Dilim Kültür Yöntemi

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kültür Sistemi Tiroid Geliştirme Çalışması

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde Aedes Aegypti, bir vektör Zika virüs

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use for Functional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activating Proteins

Nicel Dot Blot tahlil AAV titrasyon ve virüs Adeno ilişkili derleme etkinleştirme işlev değerlendirmesi için kullanımı için proteinler

While adeno-associated virus (AAV) is widely accepted as an attractive vector for gene therapy, it also serves as a model virus for understanding virus ...

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Bitki Konağındaki Bir Yaprakçık Vektörünün Virüs ve Tükürük Proteinlerinin Tespiti

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Generation of Brown Fat-Specific Knockout Mice Using a Combined Cre-LoxP, CRISPR-Cas9, and Adeno-Associated Virus Single-Guide RNA System

Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve Adeno İlişkili Virüs Tek Kılavuzlu RNA Sistemi Kullanılarak Kahverengi Yağa Özgü Nakavt Farelerin Üretimi

Brown adipose tissue (BAT) is an adipose depot specialized in energy dissipation that can also serve as an endocrine organ via the secretion of bioactive ...