Denne protokol hjælper med at dyrke knoglemarvsafledte makrofager fra iNOS- eller BH4-mangelfulde mus ved hjælp af omhyggeligt definerede medier og serum med lave niveauer af BH4 og nitrat for at undgå interferens med redoxmekanismer. Ved omhyggeligt at kontrollere niveauerne af potentielle forurenende stoffer i dyrkningsprocessen kan vi begrænse nitrogenoxidinterferens, hvilket sikrer nøjagtighed og reproducerbarhed af modelsystemet. Denne metode giver mulighed for nøjagtige målinger af biopteriner, nitrogenoxid og eventuelle downstream-faktorer relateret til disse essentielle forbindelser.
Demonstrere proceduren vil være Dr. Thomas Nichol, en postdoktoral forsker fra vores laboratorium. Til at begynde med skal du placere benene i 70% ethanol i to minutter for at vaske pels eller rester af. Overfør derefter benene til en ren, steril bakteriologisk petriskål.
Skrab forsigtigt langs længden af knoglerne med bladet, skær gennem sener og fjern musklen fra knoglen. Når knoglerne er blevet ryddet for muskler, skæres gennem epifysen øverst på skinnebenet, lige under knæet. Skinnebenet kan skæres igennem i den nederste ende, lige over krydset med fibulaen.
Til sidst skæres gennem epifysen i hver ende af lårbenet, lige kort fra knæ- og hofteleddet. For at skylle knoglemarven skal du fylde en 10 ml sprøjte med 10 ml PBS og fastgøre den til en nål. Indsæt derefter nålen i knoglens medullære hulrum.
Skyl forsigtigt med en til to milliliter PBS, og løb nålen op og ned. Træk derefter suspensionen fem til ti gange ind og ud af en sprøjte på en milliliter for at opdele. Saml suspensionen i en sprøjte på en milliliter og før den gennem en 70 mikrometer cellesil i et rent 50 ml centrifugerør.
Til sidst anbrings prøverne på is. For at fryse knoglemarv til senere brug centrifugeres cellerne ved 1000 G i fem minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten og resuspend den røde pellet i to milliliter frostvæske.
Derefter inkuberes det ved 80 grader Celsius natten over. Hvis den er frosset, afrimes suspensionen hurtigt ved 37 grader Celsius. Overfør cellesuspensionen til et rent sterilt rør indeholdende tre milliliter DMEM/F-12-medier.
Dernæst pelletere cellerne ved centrifugering. Kassér supernatanten, og genophænd pelleten i tre milliliter af det tilberedte DMEM/F-12-medie. Tæl cellerne og plade dem i ikke-TC-belagt plastvarer i det forberedte DMEM/F-12-medie.
Derefter inkuberes cellerne ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. På den femte dag fodres cellerne ved at tilføje 50% af det oprindelige volumen dmem / F-12-medier. På den sjette dag stimuleres cellerne ved at tilsætte forberedt GM-CSF til en endelig koncentration på 50 nanogram pr. Mikroliter direkte til cellekulturmediet.
På dag syv skal du fjerne alle medier fra cellerne. Vask derefter cellerne kort med forvarmet PBS og tilsæt DMEM / F-12-medier indeholdende 2% lavt endotoksin FBS, 1X penicillin eller streptomycin, L-glutamin, 25 nanogram pr. Mikroliter M-CSF og 50 nanogram pr. Mikroliter GM-CSF. Til sidst inkuberes cellerne natten over i medier for at aktivere makrofagerne til M0-fænotype.
For M1-fænotype stimuleres cellerne med 100 nanogram pr. Mikroliter LPS og 10 nanogram pr. Mikroliter IFN-gamma. For M2-fænotype stimuleres cellerne med 100 nanogram pr. Mikroliter IL-4. Inkuber cellerne natten over.
På dag otte er cellerne klar til høst eller downstream-forarbejdning alt efter forskerens behov. Medier suppleret med 10% FBS havde lignende nitrit og tetrahydrobiopterin, uanset M-CSF og GM-CSF eller LCM. Men de samlede biopterinniveauer var højere i LCM-supplerede medier.
Imidlertid blev der observeret mere variabilitet mellem forskellige LCM-batcher. PCR viste et 1030 baseparprodukt i mus af vild type, mens GCH knockout-mus producerede et 1392 baseparprodukt, der bekræftede udskæring af de kritiske exons. Tamoxifen-behandling afskaffede GCH-protein i knockout-cellerne.
Knockout- og kontrolceller producerede stadig iNOS efter LPS- og IFN-stimulering. BMDM'er dyrket fra betingede GCH knockout-mus udviste signifikant formindsket tetrahydrobiopterin og nedsat nitrit. De samme celler dyrket i LCM-medier havde intet GCH1-udtryk.
Cellerne producerer imidlertid betydelige mængder tetrahydrobiopterin og nitrit efter knockout. På den ottende dag var der ingen signifikante forskelle i morfologi mellem ikke-aktiveret kontrol og GCH knockout BMDM'er i forskellige koncentrationer af Tamoxifen. BMDM'erne viser de funktioner, der forventes af ustimulerede makrofager, med runde klæbende celler og aflange ekstremiteter.
Når du arbejder med primærcelle som denne, er det bydende nødvendigt at sterilisere alt væv og udstyr grundigt. Desuden er det vigtigt at vælge de rigtige medier og supplement for at opretholde et lavt nitrogenoxid- og BH4-miljø. Cellepiller og medier kan bruges til forskellige downstream-applikationer med fokus på rollen som nitrogenoxid, biopterin eller cellulær redoxtilstand.
Det kan blandt andet omfatte HPLC, qPCR og Western blot.