यह प्रोटोकॉल रेडॉक्स तंत्र के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए बीएच 4 और नाइट्रेट के निम्न स्तर के साथ सावधानीपूर्वक परिभाषित मीडिया और सीरम का उपयोग करके आईएनओएस या बीएच 4 की कमी वाले चूहों से व्युत्पन्न अस्थि मज्जा व्युत्पन्न मैक्रोफेज को संवर्धित करने में मदद करता है। संस्कृति प्रक्रिया में संभावित संदूषकों के स्तर को सावधानीपूर्वक नियंत्रित करके, हम नाइट्रिक ऑक्साइड हस्तक्षेप को सीमित कर सकते हैं, मॉडल प्रणाली की सटीकता और पुनरुत्पादन सुनिश्चित कर सकते हैं। यह विधि बायोप्टेरिन, नाइट्रिक ऑक्साइड और इन आवश्यक यौगिकों से संबंधित किसी भी डाउनस्ट्रीम कारकों के सटीक माप के लिए अनुमति देती है।
प्रक्रिया का प्रदर्शन डॉ थॉमस निकोल, हमारी प्रयोगशाला से एक पोस्ट-डॉक्टरेट शोधकर्ता होगा। शुरू करने के लिए, किसी भी फर या अवशेषों को धोने के लिए पैरों को दो मिनट के लिए 70% इथेनॉल में रखें। फिर, पैरों को एक साफ, बाँझ बैक्टीरियोलॉजिकल पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
ब्लेड के साथ हड्डियों की लंबाई के साथ सावधानीपूर्वक स्क्रैप करें, टेंडन के माध्यम से काटें और हड्डी से मांसपेशियों को हटा दें। एक बार जब हड्डियों को मांसपेशियों से साफ कर दिया जाता है, तो घुटने के ठीक नीचे टिबिया के शीर्ष पर एपिफिसिस के माध्यम से काट दिया जाता है। टिबिया को फाइबुला के साथ चौराहे के ठीक ऊपर, नीचे के छोर पर काटा जा सकता है।
अंत में, फीमर के किसी भी छोर पर एपिफिसिस के माध्यम से काटें, बस घुटने और कूल्हे के जोड़ों से कम। अस्थि मज्जा को फ्लश करने के लिए, पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें और इसे एक सुई से जोड़ें। फिर सुई को हड्डी की मज्जा गुहा में डालें।
धीरे से पीबीएस के एक से दो मिलीलीटर के साथ फ्लश करें, सुई को ऊपर और नीचे चलाएं। फिर, निलंबन को एक मिलीलीटर सिरिंज के अंदर और बाहर पांच से दस बार अलग करने के लिए खींचें। एक मिलीमीटर सिरिंज में निलंबन ले लीजिए और एक साफ 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में एक 70 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से पारित करें।
अंत में, नमूनों को बर्फ पर रखें। बाद के उपयोग के लिए अस्थि मज्जा को फ्रीज करने के लिए, कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए 1000 जी पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant त्यागें और antifreeze के दो milliliters में लाल गोली resuspend.
फिर, इसे रात भर में 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि जमे हुए हैं, तो निलंबन को 37 डिग्री सेल्सियस पर तेजी से डीफ्रॉस्ट करें। DMEM / F-12 मीडिया के तीन मिलीलीटर युक्त एक साफ बाँझ ट्यूब के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण।
इसके बाद, सेंट्रीफ्यूगेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली मारें। supernatant त्यागें और तैयार DMEM / F-12 मीडिया के तीन milliliters में गोली resuspend. कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें तैयार DMEM / F-12 मीडिया में गैर-टीसी लेपित प्लास्टिक के बर्तन में प्लेट करें।
इसके बाद, कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। पांचवें दिन, DMEM / F-12 मीडिया की मूल मात्रा का 50% जोड़कर कोशिकाओं को फ़ीड करें। छठे दिन, सेल संस्कृति मीडिया के लिए सीधे 50 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की अंतिम एकाग्रता के लिए तैयार जीएम-सीएसएफ को जोड़कर कोशिकाओं को उत्तेजित करें।
सातवें दिन, कोशिकाओं से सभी मीडिया को हटा दें। फिर, कोशिकाओं को पहले से गर्म पीबीएस के साथ संक्षेप में धोएं और 2% कम एंडोटॉक्सिन एफबीएस, 1एक्स पेनिसिलिन या स्ट्रेप्टोमाइसिन, एल-ग्लूटामाइन, 25 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर एम-सीएसएफ, और 50 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर जीएम-सीएसएफ युक्त डीएमईएम / एफ -12 मीडिया जोड़ें। अंत में, एम 0 फेनोटाइप के लिए मैक्रोफेज को सक्रिय करने के लिए मीडिया में रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
एम 1 फेनोटाइप के लिए, प्रति माइक्रोलीटर एलपीएस 100 नैनोग्राम के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें, और 10 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर आईएफएन-गामा। एम 2 फेनोटाइप के लिए, प्रति माइक्रोलीटर आईएल -4 100 नैनोग्राम के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें। कोशिकाओं को रात भर इनक्यूबेट करें।
आठवें दिन, कोशिकाएं शोधकर्ता की जरूरतों के अनुसार फसल या डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण के लिए तैयार होती हैं। 10% FBS के साथ पूरक मीडिया में एम-सीएसएफ और जीएम-सीएसएफ, या एलसीएम की परवाह किए बिना समान नाइट्राइट और टेट्राहाइड्रोबिओप्टेरिन थे। लेकिन कुल बायोप्टेरिन का स्तर एलसीएम पूरक मीडिया में अधिक था।
हालांकि, विभिन्न एलसीएम बैचों के बीच अधिक परिवर्तनशीलता देखी गई थी। पीसीआर ने जंगली प्रकार के चूहों में 1030 बेस पेयर उत्पाद दिखाया, जबकि जीसीएच नॉकआउट चूहों ने 1392 बेस पेयर उत्पाद का उत्पादन किया, जो महत्वपूर्ण एक्सोन के उच्छेदन की पुष्टि करता है। Tamoxifen उपचार नॉकआउट कोशिकाओं में GCH प्रोटीन को समाप्त कर दिया।
नॉकआउट और नियंत्रण कोशिकाओं ने अभी भी एलपीएस और आईएफएन उत्तेजना के बाद आईएनओएस का उत्पादन किया। सशर्त जीसीएच नॉकआउट चूहों से सुसंस्कृत बीएमडीएम ने काफी कम टेट्राहाइड्रोबिओप्टेरिन का प्रदर्शन किया और नाइट्राइट में कमी आई। LCM मीडिया में सुसंस्कृत एक ही कोशिकाओं में कोई GCH1 अभिव्यक्ति नहीं थी।
हालांकि, कोशिकाएं नॉकआउट के बाद टेट्राहाइड्रोबिओप्टेरिन और नाइट्राइट की महत्वपूर्ण मात्रा का उत्पादन करती हैं। आठवें दिन, टैमोक्सीफेन की विभिन्न सांद्रता में गैर-सक्रिय नियंत्रण और जीसीएच नॉकआउट बीएमडीएम के बीच आकृति विज्ञान में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। BMDM उन विशेषताओं को प्रदर्शित करते हैं जो अगुवा मैक्रोफेज की उम्मीद करते हैं, जिसमें गोल अनुयायी कोशिकाएं और लम्बी चरम सीमाएं होती हैं।
इस तरह के प्राथमिक सेल के साथ काम करते समय, सभी ऊतकों और उपकरणों को अच्छी तरह से निष्फल करना आवश्यक है। इसके अलावा, सही मीडिया और पूरक का चयन करना कम नाइट्रिक ऑक्साइड और बीएच 4 वातावरण को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल छर्रों और मीडिया का उपयोग नाइट्रिक ऑक्साइड, बायोप्टेरिन, या सेलुलर रेडॉक्स राज्य की भूमिका पर ध्यान केंद्रित करने के साथ विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।
इसमें एचपीएलसी, क्यूपीसीआर और पश्चिमी धब्बा शामिल हो सकते हैं, अन्य के बीच।
