Nøytrofiler er terminalt differensierte celler, og for tiden er det ingen cellelinjer for å fullstendig rekapitulere nøytrofilbiologi. Dermed er det nødvendig å skaffe rene, inaktiverte, sunne og friske nøytrofiler for å studere deres biologi. Denne oppdateringsmetoden kombinerer tetthetsgradient, sedimentering, skånsom lysis for å oppnå et rent nøytrofilt preparat.
Det er enkelt å sette opp, krever enkelt utstyr og lite øvelse. Det tekniske aspektet, for eksempel graderingslag, av denne metoden vil kreve litt øvelse å mestre, men når gradienten er perfeksjonert, bør de andre trinnene komme som en lek. Begynn med å sterilisere den buffy kappen, emballasjen og laminær hetten.
Tilsett deretter 10 milliliter blod i et 50 milliliterrør. For å fortynne blodet for en renere gradient, tilsett 5% FBS / HBSS og sminke volumet opp til 35 milliliter. Etter å ha lukket lokket, snu røret flere ganger for blanding og hold deretter røret opp ned for å oppnå bunnen uten røde blodlegemer.
Tilsett 10 milliliter av tetthetsgradientmediet rett under blodet, og sørg for at mediet og blodet ikke blandes og grensesnittet forblir skarpt. Snurr røret 400 ganger g i 30 minutter ved romtemperatur, og sørg for å deaktivere bremsen. Etter spinning, observere gradienten separert i en topp serum plasma lag, en midthvit ring av perifere blod mononukleære celler, en overskyet tetthet gradient medium lag, og en bunn pellet bestående av en hvit tynn nøytrofil bånd på toppen av de røde blodlegemer.
For å fjerne PBMC, kom sugepipetten direkte inn i PBMC-laget og aspirer helt mens serumplasmalaget reduseres etter hvert som ringen fjernes. Skrap siden av røret med sugepipetten for å maksimere fjerningen av PBMC. Fjern forsiktig det uklare tetthetsgraderingsmediumlaget mellom PBMC-ringen og nøytrofil/ RBC-pelletsen.
For erytrocyttsedimentering, bruk en 10 milliliter pipette for å overføre nøytrofil / RBC pellet til et rent rør. Legg deretter 5%FBS/HBSS til et endelig volum på 25 milliliter. Tilsett direkte 25 milliliter av den forhåndsvarslede løsningen som inneholder 3% dextran / 0,9% NaCl i vann i røret og bland forsiktig ved inversjon.
Plasser røret på en utjevnet og ikke-vibrerende overflate i 15 minutter. Etter å ha plassert røret tilbake i hetten, senk pipetten litt ned i væsken og samle ca. 30 milliliter av topplaget etter væskeoverflaten nedover. Snurr røret for å få en rød pellets uten flytende partikler i mediet.
For lysis av gjenværende RBC, aspirer forsiktig supernatanten uten å forstyrre pelletsen. Tilsett 25 millimeter sterilt ultrarent vann direkte inn i røret og bland forsiktig ved å invertere røret i 28 sekunder for å lyse RBC. Tilsett deretter umiddelbart 25 milliliter steril 1,8% NaCl-løsning fremstilt i vann i røret og bringe løsningen tilbake til isotoniske forhold ved skånsom blanding.
Snurr røret 200 ganger g i tre til fem minutter med lav brems for å minimere sedimentering av RBC og blodplater med nøytrofiler. For resuspending den hvite nøytrofil pellet, legg direkte til kulturmediet på pelletsen, men ikke pipette opp og ned. Deretter gynger du røret horisontalt fra side til side for å minimere celleaktivering.
Hvis celleaggregering eller klumping observeres, filtrerer du celleopphenget gjennom et 70 mikrometer nett for å kaste de klumpede nøytrofiler. For å vurdere kvaliteten på det isolerte nøytrofilpreparatet, flekk cellene med markører som er spesifikke for nøytrofiler, eosinofiler og en aktiveringsmarkør. Etter å ha anskaffet 20 000 celler ved strømningscytometri, analyser cellerenheten og aktiveringen ved hjelp av gatingstrategiene og bestem celle levedyktigheten ved hjelp av Annexin V / propidiumjodid som beskrevet i tekstmanuskriptet.
Tetthetsgradienten med lav hastighet ga nøytrofiler med mer renhet, mens en høy hastighet resulterte i økt utbytte på bekostning av renhet. Ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering ga cellefordelingen alene et estimat av celleisolasjonskvaliteten, men bruken av spesifikke cellemarkører bør foretrekkes. De forurensende cellepopulasjonene som ble identifisert var monocytter, lymfocytter og eosinofiler.
Det enorme nøytrofilutbyttet ble oppnådd ved hjelp av denne protokollen. Uttrykket av CD62L ble vurdert. Gjennomsnittlig fluorescerende intensitet for CD62L ble redusert i de positive kontrollcellene, noe som indikerer CD62L shedding og nøytrofil aktivering.
Nøytrofilhelsen bør vurderes før analysen utføres, da nøytrofiler har en relativt kort halveringstid og aktivering forkorter livet ytterligere. Etter nøytrofil rensing ved hjelp av tetthetsgradienten og kommersielle mikrober, ble cellene dyrket i 24 timer og celleoverlevelse ble analysert av strømningscytometri. Kvantifiseringen av levedyktige celler indikerte at tetthetsgradientrensingen resulterte i mer levedyktige celler etter 24 timer enn rensing ved hjelp av et sett.
Det er viktig at graderingslaget og sentrifugeringstrinnene utføres så godt som mulig, da det i stor grad vil påvirke kvaliteten på preparatet. In vitro eksperimenter og biokjemiske analyser kan utføres etter denne prosedyren. Også negativ seleksjon kan utføres hvis ultrapure celler er nødvendig som i cytokin og protein uttrykk eksperimenter.
