Name: measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex
Uploaded: 2021-08-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex at JoVE.com

Wir danken der Wilhelm Sander-Stiftung (2017.008.02), dem Center of Dynamic Systems (CDS), gefördert durch das EU-Programm EFRE (Europäischer Fonds für regionale Entwicklung) und der DFG (LA 2386) für die Unterstützung unserer Arbeit. Wir danken Karina Guttek für die Unterstützung unserer Experimente. Wir danken Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) für die Bereitstellung von primären T-Zellen.

T-Zell-Experimente wurden gemäß der ethischen Vereinbarung 42502-2-1273 Uni MD durchgeführt.
1. Zellen für das Experiment vorbereiten
HINWEIS: Die durchschnittliche Anzahl der Zellen für diese Immunpräzipitation beträgt 1 × 107. Adhärente Zellen müssen einen Tag vor dem Experiment ausgesät werden, so dass es am Tag des Experiments 1 ×10 7 Zellen gibt.
<ol><li>Adhärenzzellen für das Experiment vorbereiten<ol>
<li>Same...

<ol>
	<li>Lavrik, I. N., Krammer, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CD95/Fas+signaling+at+the+DISC.">Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).</li><li>Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+and+death+in+peripheral+T+cells.">Life and death in peripheral T cells.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).</li><li>Dickens, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+death+effector+domain+chain+DISC+model+reveals+a+crucial+role+for+caspase-8+chain+assembly+in+mediating+apoptotic+cell+death.">A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death.</a> Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).</li><li>Fu, T. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structure+of+caspase-8+tandem+DED+filament+reveals+assembly+and+regulation+mechanisms+of+the+death-inducing+signaling+complex.">Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex.</a> Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).</li><li>Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLICE+is+predominantly+expressed+as+two+functionally+active+isoforms,+caspase-8/a+and+caspase-8/b.">FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).</li><li>Fox, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structural+analysis+of+FADD:Caspase-8+complexes+defines+the+catalytic+dimer+architecture+for+co-ordinated+control+of+cell+fate.">Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+of+the+CD95+death-inducing+signaling+complex:+experimental+and+modeling+evidence+for+a+death+effector+domain+chain+model.">Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model.</a> Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+death-inducing+signaling+complex+reveals+a+substrate+switch+that+determines+CD95-mediated+death+or+survival.">Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival.</a> Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).</li><li>Lavrik, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+active+caspase-8+heterotetramer+is+formed+at+the+CD95+DISC+[2].">The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2].</a> Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).</li><li>Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+C-terminal+cleavage+product+of+procaspase-8,+p30,+defines+an+alternative+pathway+of+procaspase-8+activation.">A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).</li><li>Golks, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+CAP3+in+CD95+signaling:+New+insights+into+the+mechanism+of+procaspase-8+activation.">The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation.</a> Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).</li><li>Ozt&#252;rk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+FLICE-like+inhibitory+proteins+(c-FLIPs):+Fine-tuners+of+life+and+death+decisions.">Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions.</a> Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).</li><li>Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=c-FLIPR,+a+new+regulator+of+death+receptor-induced+apoptosis.">c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).</li><li>Hughes, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-operative+and+hierarchical+binding+of+c-FLIP+and+caspase-8:+A+unified+model+defines+how+c-FLIP+isoforms+differentially+control+cell+fate.">Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate.</a> Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+and+short+isoforms+of+c-FLIP+act+as+control+checkpoints+of+DED+filament+assembly.">Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly.</a> Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).</li><li>Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+procaspase-8+activation+by+c-FLIPL.">Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).</li><li>Micheau, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+form+of+FLIP+is+an+activator+of+caspase-8+at+the+Fas+death-inducing+signaling+complex.">The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).</li><li>Chang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-FLIPL+is+a+dual+function+regulator+for+caspase-8+activation+and+CD95-mediated+apoptosis.">C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis.</a> EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).</li><li>Hillert, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+DISC+regulation+via+pharmacological+targeting+of+caspase-8/c-FLIPL+heterodimer.">Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).</li><li>Fricker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+dissection+of+CD95+signaling+dynamics+reveals+both+a+pro-+and+antiapoptotic+role+of+c-FLIPL.">Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL.</a> Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).</li><li>Arndt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+TCR+activation+kinetics+in+primary+human+T+cells+upon+focal+or+soluble+stimulation.">Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).</li><li>Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+treatment+of+CD95L+and+gemcitabine+in+pancreatic+cancer+cells+induces+apoptotic+and+RIP1-mediated+necroptotic+cell+death+network.">Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network.</a> Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+DED+chains+at+the+DISC:+regulation+of+procaspase-8+activation+by+short+DED+proteins+c-FLIP+and+procaspase-8+prodomain.">Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain.</a> Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).</li><li>Lavrik, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+CD95+threshold+signaling:+Triggering+of+CD95+(FAS/APO-1)+at+low+concentrations+primarily+results+in+survival+signaling.">Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).</li><li>Sprick, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspase-10+is+recruited+to+and+activated+at+the+native+TRAIL+and+CD95+death-inducing+signalling+complexes+in+a+FADD-dependent+manner+but+can+not+functionally+substitute+caspase-8.">Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8.</a> EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).</li><li>Neumann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+within+the+CD95+death-inducing+signaling+complex+decide+life+and+death+of+cells.">Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).</li><li>Kischkel, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotoxicity-dependent+APO-1+(Fas/CD95)-associated+proteins+form+a+death-inducing+signaling+complex+(DISC)+with+the+receptor.">Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor.</a> EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).</li><li>Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+sweet+regulation+of+apoptosis:+the+role+of+glycosylation+and+galectins+in+apoptotic+signaling+pathways.">Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways.</a> Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).</li><li>Kallenberger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-+and+interdimeric+caspase-8+self-cleavage+controls+strength+and+timing+of+CD95-induced+apoptosis.">Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis.</a> Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).</li></ol>

Dieser Ansatz wurde erstmals von Kischkel et al.27 beschrieben und seitdem von mehreren Gruppen erfolgreich entwickelt. Für eine effiziente DISC-Immunpräzipitation und überwachung der Caspase-8-Verarbeitung in diesem Komplex müssen mehrere wichtige Aspekte berücksichtigt werden.
Erstens ist es wichtig, alle Waschschritte während der Immunpräzipitation zu befolgen. Besonders wichtig sind die letzten Waschschritte der Sepharoseperlen und das Trocknen der Sepharosep...

Einer der am besten untersuchten Todesrezeptoren (DRs) ist CD95 (Fas, APO-1). Der extrinsische apoptotische Signalweg beginnt mit der Interaktion des DR mit seinem verwandten Liganden, d.h. CD95L interagiert mit CD95 oder TRAIL bindet an TRAIL-Rs. Dies führt zur Bildung der DISC an der entsprechenden DR. DISC besteht aus CD95, FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP Proteinen1,2. Darüber hinaus wird die DISC durch Wechselwirkungen zwischen Death Domain (DD)-haltigen Proteinen wie CD95 und FADD und DED-haltigen Proteinen wie FADD, Procaspase-8/-10 und c-FLIP zusammengesetzt (Abbildung 1). Procaspase-8 wird durch Assoziation seiner DEDs oligomerisiert, was zur Bildung von DED-Filamenten führt, gefolgt von procaspase-8-Aktivierung und -Verarbeitung. Dies löst eine Caspase-Kaskade aus, die zum Zelltod führt (Abbildung 1)3,4. Somit ist Procaspase-8 eine zentrale Initiator-Caspase des extrinsischen Apoptoseweges, vermittelt durch CD95 oder den TRAIL-Rs, aktiviert an der entsprechenden makromolekularen Plattform, DISC.
Es ist bekannt, dass zwei Isoformen von Procaspase-8, nämlich Procaspase-8a (p55) und -8b (p53), für die DISC5rekrutiert wurden. Beide Isoformen bestehen aus zwei DEDs. DED1 und DED2 befinden sich im N-terminalen Teil der Procaspase-8a/b, gefolgt von den katalytischen Domänen p18 und p10. Eine detaillierte Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) Analyse von Procaspase-8-DEDs ergab die Assemblierung von Procaspase-8-Proteinen zu fadenförmigen Strukturen, den sogenannten DED-Filamenten4,6. Bemerkenswerterweise wurde zunächst vorgeschlagen, dass die linearen Procaspase-8-Ketten an der Dimerisierung beteiligt sind, gefolgt von der Procaspase-8-Aktivierung an der DISC. Nun ist bekannt, dass diese Ketten nur eine Unterkonstruktion des Procaspase-8-DED-Filaments sind, das aus drei Ketten besteht, die zu einer Dreifachhelix3, 4,6,7zusammengesetzt sind.
Bei der Dimerisierung am DED-Filament führen Konformationsänderungen in der Procaspase-8a/b zur Bildung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und seiner Aktivierung3,8. Es folgt die Procaspase-8-Verarbeitung, die über zwei Wege vermittelt wird: Der erste geht über die Erzeugung eines p43/p41-Spaltprodukts und der zweite über die initiale Erzeugung eines p30-Spaltprodukts. Der p43/p41-Signalweg wird durch die Spaltung von Procaspase-8a/b an Asp374 eingeleitet, was zu p43/p41- und p12-Spaltprodukten führt (Abbildung 2). Ferner werden diese Fragmente bei Asp384 und Asp210/216 automatisch katalytisch gespalten, was zur Bildung des aktiven Caspase-8-Heterotetramers, p102/p1829, 10,11führt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass parallel zum p43/p41-Verarbeitungsweg auch procaspase-8a/b an Asp216 gespalten wird, was zur Bildung des C-terminalen Spaltprodukts p30 führt, gefolgt von dessen Proteolyse zu p10 und p1810 (Abbildung 2).
Die Procaspase-8a/b-Aktivierung am DED-Filament wird streng durch Proteine namens c-FLIPs12reguliert. Die c-FLIP Proteine kommen in drei Isoformen vor: c-FLIPLong (c-FLIPL), c-FLIPShort (c-FLIPS) und c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle drei Isoformen enthalten zwei DEDs in ihrem N-terminalen Bereich. c-FLIPL hat auch eine C-terminale katalytisch inaktive Caspase-ähnliche Domäne12,13. Beide kurzen Isoformen von c-FLIP-c-FLIPS und c-FLIPRwirken anti-apoptotisch, indem sie die Bildung von DED-Filamenten an der DISC 6,14,15stören. Darüber hinaus kann c-FLIPL die Caspase-8-Aktivierung konzentrationsabhängig regulieren. Dies kann sowohl zu pro- als auch zu anti-apoptotischen Wirkungen führen16,17,18. Durch die Bildung des katalytisch aktiven Procaspase-8/c-FLIPL Heterodimers führt c-FLIPL zur Stabilisierung des aktiven Zentrums von Procaspase-8 und dessen Aktivierung. Die pro- oder anti-apoptotische Funktion von c-FLIPL ist direkt abhängig von seiner Menge an den DED-Filamenten und der anschließenden Menge an zusammengesetzten Procaspase-8/c-FLIPL Heterodimeren19. Niedrige oder mittlere Konzentrationen von c-FLIPL an der DISC führen zu ausreichenden Mengen an Procaspase-8/c-FLIP L-Heterodimeren am DED-Filament, was die Aktivierung von Caspase-8 unterstützt. Im Gegensatz dazu führen erhöhte Mengen an c-FLIPL direkt zu seiner anti-apoptotischen Wirkung an der DISC20.
Zusammengenommen ist die Aktivierung und Verarbeitung von Procaspase-8a/b am DISC ein stark regulierter Prozess, der mehrere Schritte umfasst. Dieser Beitrag diskutiert die Messung der Procaspase-8-Verarbeitung direkt am DISC sowie die Analyse der Zusammensetzung dieses Komplexes. Dies wird anhand der CD95 DISC als exemplarischem DR-Komplex präsentiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12.5% SDS gel</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>for two separating gels: 
			3.28 mL distilled H2O 
			2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 
			4.06 mL acrylamide 
			100 &#181;L 10% SDS 
			100 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED 
			 
			for two collecting gels: 
			3.1 mL distilled H2O 
			1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 
			0.5 mL acrylamide 
			50 &#181;L 10% SDS 
			25 &#181;L 10% APS 
			7.5 &#181;L TEMED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14.5 cm cell dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>639160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylamide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A124.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-actin Ab</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2103</td>
			<td>dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-APO-1 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo</td>
			<td>ALX-805-038-C100</td>
			<td>used only for immunoprecipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-10 Ab</td>
			<td>Biozol</td>
			<td>MBL-M059-3</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-3 Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9662 S</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-caspase-8 Ab C15</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-242-C100</td>
			<td>dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD95 Ab</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-715</td>
			<td>dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-c-FLIP NF6 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-804-961-0100</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-FADD 1C4 Ab</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ADI-AAM-212-E</td>
			<td>dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PARP Ab</td>
			<td>cell signaling</td>
			<td>9542</td>
			<td>dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9592.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford solution 
			Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD95L</td>
			<td>provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO</td>
			<td>ALX-522-020-C005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chemoluminescence detector 
			Chem Doc XRS+</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>11 836 145 001</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x) w/o Ca, Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-53500</td>
			<td>dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eletrophoresis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>10x electrophoresis buffer: 
			60.6 g Tris 
			288 g glycine 
			20 g SDS 
			ad 2 L H2O 
			1:10 dilution before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3908.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG1 HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1070-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG2b</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1090-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>4030-05</td>
			<td>dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interleukin-2 Human(hIL-2)</td>
			<td>Merckgroup/ Roche</td>
			<td>11011456001</td>
			<td>for activation of T cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading buffer 
			4x Laemmli Sample Buffer,10 mL</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0747</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminata Forte Western HRP substrate</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUFO500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysis buffer</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 
			27.5 mL NaCl; 5 M 
			10 mL EDTA; 2 mM 
			100 mL Triton X-100 
			add 960 mL H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine,&#160; 2,438 g/L</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-41154</td>
			<td>adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium for primary T cells</td>
			<td>gibco by Life Technologie</td>
			<td>21875034</td>
			<td>adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P030.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3957.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>20x PBST: 
			230 g NaCl 
			8 g KCl 
			56.8 g Na2HPO4 
			8 g KH2PO4 
			20 mL Tween-20 
			ad 2 L H2O 
			dilution 1:20 before usage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST + 5% milk</td>
			<td>self made</td>
			<td></td>
			<td>50 g milk powder + 1 L PBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R30852801</td>
			<td>for actavation of T ells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Pac HC</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Standard All Blue</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0373</td>
			<td>use between 3-5 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B beads</td>
			<td>Novodirect/ Th.Geyer</td>
			<td>GE 17-0780-01</td>
			<td>affinity resin beads prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scraper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4360.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K305.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>10026938</td>
			<td>prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>170-4270</td>
			<td>used according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot-Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Chem Solute</td>
			<td>8,08,51,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3051.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Pan Reac Appli Chem</td>
			<td>A4974,1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring composition of cd95 death-inducing signaling complex and processing of procaspase-8 in this complex

Die extrinsische Apoptose wird durch die Aktivierung von Todesrezeptoren (DRs) wie CD95/Fas/APO-1 oder Tumornekrosefaktor-bedingtem Apoptose-induzierendem Liganden (TRAIL)-Rezeptor 1/Rezeptor 2 (TRAIL-R1/R2) vermittelt. Die Stimulation dieser Rezeptoren mit ihren verwandten Liganden führt zum Aufbau des todinduzierenden Signalkomplexes (DISC). DISC umfasst DR, das Adapterprotein Fas-assoziiertes Protein mit Todesdomäne (FADD), Procaspasen-8/-10 und zelluläre FADD-ähnliche Interleukin (IL)-1β-converting enzyme-inhibitory proteins (c-FLIPs). Die DISC dient als Plattform für die Procaspase-8-Verarbeitung und -Aktivierung. Letzteres geschieht durch seine Dimerisierung / Oligomerisierung in den an der DISC zusammengesetzten Filamenten der Death Effector Domain (DED). 
Auf die Aktivierung von Procaspase-8 folgt seine Verarbeitung, die in mehreren Schritten erfolgt. In dieser Arbeit wird ein etablierter experimenteller Workflow beschrieben, der die Messung der DISC-Bildung und die Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex ermöglicht. Der Workflow basiert auf Immunpräzipitationstechniken, die durch die Western-Blot-Analyse unterstützt werden. Dieser Workflow ermöglicht eine sorgfältige Überwachung verschiedener Schritte der Procaspase-8-Rekrutierung in die DISC und ihrer Verarbeitung und ist für die Untersuchung molekularer Mechanismen der extrinsischen Apoptose von hoher Relevanz.

Um die Caspase-8-Rekrutierung auf die DISC und deren Verarbeitung an der CD95 DISC zu analysieren, beschreibt dieses Papier einen klassischen Workflow, der IP der CD95 DISC mit Western-Blot-Analyse kombiniert. Dies ermöglicht den Nachweis mehrerer Schlüsselmerkmale der Caspase-8-Aktivierung an der DISC: die Montage der Caspase-8-aktivierenden makromolekularen Plattform, die Rekrutierung von Procaspase-8 in die DISC und die Verarbeitung dieser Initiator-Caspase (Abbildung 1 und <strong clas...

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Measuring Composition of CD95 Death-Inducing Signaling Complex and Processing of Procaspase-8 in this Complex

Hier wird ein experimenteller Workflow vorgestellt, der den Nachweis der Caspase-8-Verarbeitung direkt am todesinduzierenden Signalkomplex (DISC) ermöglicht und die Zusammensetzung dieses Komplexes bestimmt. Diese Methodik hat breite Anwendungen, von der Entschlüsselung der molekularen Mechanismen von Zelltodwegen bis hin zur dynamischen Modellierung von Apoptose-Netzwerken.

Messung der Zusammensetzung von CD95 Death-Inducing Signaling Complex und Verarbeitung von Procaspase-8 in diesem Komplex

Extrinsic apoptosis is mediated by the activation of death receptors (DRs) such as CD95/Fas/APO-1 or tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ...

Die Apoptose-Initiation wird durch die Aktivierung von Caspasen an molekularen Markerplattformen vermittelt. Wir präsentieren den Nachweis des Schlüsselinitiationszelltodkomplexes DISC, der als Plattform für die Caspase-8-Aktivierung dient. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Erkennung der Baugruppe und der Zusammensetzung des DISC-Komplexes ermöglicht und Informationen über die Caspase-8-Verarbeitung in diesem Komplex liefert.Beginnen Sie das Experiment mit Zellen, die zu 80% bis 90% konfluent sind und an der Schale haften. Verwerfen Sie das Medium und fügen Sie den adhärenten Zellen frisches Medium hinzu. Stimulieren Sie dann die Zellen mit der ausgewählten Konzentration von CD95L, indem Sie die Platte in einem Winkel halten und den Liganden in das Medium pipettieren, ohne die adhäsiven Zellen zu berühren.Um die Zellen zu ernten, legen Sie die Zellschale auf Eis. Geben Sie 10 Milliliter kaltes PBS in die Zellsuspension und kratzen Sie die angeschlossenen Zellen von der Platte ab. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50-Milliliter-Röhrchen.Waschen Sie die Zellschale zweimal mit 10 Milliliter kaltem PBS und geben Sie die Waschlösung in dasselbe 50-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspen Sie das Zellpellet in einem Milliliter kaltem PBS.Anschließend wird die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen gegeben. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension und resuspenieren Sie das Zellpellet wieder in einem Milliliter kaltem PBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation noch einmal, dann resuspen Sie das Zellpellet in einem Milliliter Lysepuffer und inkubieren Sie es für 30 Minuten auf Eis.Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Lysat mit maximaler Geschwindigkeit für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und geben Sie den Überstand dann in ein sauberes Rohr. Entsorgen Sie das Pellet und sammeln Sie eine 50-Mikroliter-Probe des Lysats in einem anderen Röhrchen, um die Proteinkonzentration zu bestimmen. Zur Immunpräzipitation fügen Sie dem Lysat zwei Mikroliter Anti-APO1-Antikörper und 10 Mikroliter vorbereitete Protein A Sepharose-Perlen hinzu.10 Mikroliter der Perlen allein in ein separates Röhrchen geben, das das Lysat enthält, um als Perlenkontrolle zu dienen. Die Mischung, die das Lysat, die Antikörper und die Protein A Sepharoseperlen enthält, über Nacht bei vier Grad Celsius mit sanfter Vermischung inkubieren. Am nächsten Tag zentrifugieren Sie die Mischung bei 500 mal G für vier Minuten bei vier Grad Celsius.Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, waschen Sie die Perlen, indem Sie einen Milliliter kaltes PBS hinzufügen und den Überstand nach der Zentrifugation verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt mindestens dreimal. Nachdem Sie die letzte PBS-Wäsche entsorgt haben, saugen Sie die Perlen vorzugsweise mit einer 50-Mikroliter-Hamilton-Spritze ab.Um den Western Blot durchzuführen, fügen Sie 20 Mikroliter 4X Ladepuffer zu den Perlen hinzu und erhitzen Sie ihn 10 Minuten lang bei 95 Grad Celsius. Gleichzeitig erhitzen Sie die Lysatsteuerung bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Laden Sie die Lysate, Immunpräzipitiva und einen Proteinstandard auf ein 12,5% SDS-Gel und laufen Sie mit einer konstanten Spannung von 80 Volt.Nachdem der Gellauf abgeschlossen ist, übertragen Sie die Proteine aus dem SDS-Gel auf eine Nitrocellulosemembran. Nachdem der Transfer abgeschlossen ist, legen Sie die abgefleckte Membran in eine Box und inkubieren Sie sie für eine Stunde in Blocklösung unter sanfter Bewegung, dann waschen Sie die Membran dreimal für fünf Minuten mit PBST. Um die Proteine nachzuweisen, geben Sie den ersten primären Antikörper in der angegebenen Verdünnung in die Membran und inkubieren Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanfter Bewegung.Am nächsten Tag waschen Sie die Membran mit drei Fünf-Minuten-PBST-Waschungen, dann inkubieren Sie die Membran mit 20 Millilitern Sekundärantikörper mit sanftem Schütteln für eine Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran dreimal mit PBST erneut. Nachdem Sie die letzte PBST-Wäsche verworfen haben, geben Sie etwa einen Milliliter Meerrettichperoxidase-Substrat in die Membran und erkennen Sie das Chemolumineszenzsignal.Die Stimulation von Gebärmutterhalskrebs-HeLa-CD95-Zellen mit CD95L führte zu einer hohen CD95-DISC-Bildung, die über die CD95-Immunpräzipitation überwacht wurde. CD95, FADD, Procaspase-8, Procaspase-10 und c-FLIPS wurden in diesen CD95-Immunpräzipitationen beobachtet, was auf eine effiziente DISC-Bildung hinweist. Die Spaltprodukte von p43-FLIP und p22-FLIP wurden in den Immunpräzipitationen nachgewiesen, was auf eine Caspase-8-Aktivierung hinweist.HeLa-CD95-Zellen, die c-FLIP long überexprimieren, wurden zur Analyse der CD95-DISC-Bildung verwendet. Ähnlich wie bei elterlichen HeLa-CD95-Zellen wurde in den Immunpräzipitationen dieser Zellen ohne CD95L-Behandlung keine Rekrutierung von FADD-, Procaspase-9-, Procaspase-10-, c-FLIP-Proteinen und PARP1 nachgewiesen. Aktivierte primäre T-Zellen waren durch hohe Konzentrationen von CD95, FADD, Procaspase-8, Procaspase-10 und c-FLIPS in Anti-CD95-Immunpräzipitationen gekennzeichnet.Diese Technik ermöglicht die Analyse der molekularen DISC-Bildung, einschließlich der Verarbeitung von Caspase-8 an der DISC. Alle Waschschritte sind sehr wichtig. Zudem sollten Stimulationspunkte und Inkubationszeiten ernst genommen werden.Nur so kann die Baugruppe auf dem DISC-Komplex vermessen werden. Um die Caspase-8-Aktivierung zu messen, kann man jedoch auch Caspase-8-Aktivitätsassays implementieren. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, neue Einblicke in die Apoptose-Initiation zu gewinnen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture von Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Forschung

Biochemie

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Ein Verfahren zur Messung des Metabolismus in sortierter Subpopulationen von komplexen Zell Gemeinschaften Verwendung stabiler Isotopen-Tracing

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Herstellung von Riesenvesikeln Encapsulating Microspheres durch Zentrifugation einer Wasser-in-Öl-Emulsion

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

A Modified Yeast-one Hybrid System for Heteromeric Protein Complex-DNA Interaction Studies

Ein modifiziertes Hefe-ein-Hybrid-System für Heteromere Protein-Komplex-DNA-Interaktionsstudien

Over the years, the yeast one-hybrid assay has proven to be an important technique for the identification and validation of physical interactions between ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting Analyse der Übersetzung Einleitung Komplexbildung auf Säugetier-mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisches Screening und Charakterisierung des Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex für eine erfolgreiche Kristallisation

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Crystallization and Structural Determination of an Enzyme:Substrate Complex by Serial Crystallography in a Versatile Microfluidic Chip

Kristallisation und strukturelle Bestimmung eines Enzyms: Substratkomplex durch serielle Kristallisation in einem vielseitigen mikrofluidischen Chip

The preparation of well diffracting crystals and their handling before their X-ray analysis are two critical steps of biocrystallographic studies. We ...

Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads

Komplementierung der Spleißaktivität durch einen Galectin-3 - U1 snRNP Komplex auf Perlen

Classic depletion-reconstitution experiments indicate that galectin-3 is a required splicing factor in nuclear extracts. The mechanism of incorporation of ...