Name: direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

我们要感谢Oxford Nanoimaging的建设性反馈和指导。这项工作由5UM1CA121947-10资助给R.P.M.和1R01DA040394给D.P.D.

1 细胞系的繁殖和维护
<ol><li>获取人骨肉瘤细胞（U2OS），并将细胞置于补充有10%外泌体游离胎牛血清和1x青霉素/链霉素溶液的生长培养基中。 注意：无外泌体的胎牛血清是按照McNamara等人提出的方案产生的。26.</li>
	<li>将U2OS细胞在37°C的铜包衣培养箱中保持在5%CO2中，并在T175烧瓶26，27中传代细胞。细胞必须保持在对数生长?...

EV已成为一个受欢迎的研究领域，因为它们在许多细胞内过程和细胞间信号传导中起着重要作用1，30。然而，它们的可视化被证明是困难的，因为它们的小尺寸低于光学显微镜的衍射极限。直接随机光学重建显微镜（dSTORM）是一种直接的可视化方法，它通过捕获单个荧光团随时间推移的光开关事件并根据这些闪烁事件重建图像来绕过衍射极限<sup class="xre...

细胞外囊泡（EV）是由所有细胞类型释放的膜结合囊泡。它们含有脂质，蛋白质，代谢物和核酸，并在细胞之间局部转移这些物质，并在组织和器官之间远端转移。EV有三种主要亚型：凋亡体，微囊泡和外泌体1，2。在这里，我们将讨论重点放在外泌体及其相关蛋白质上。
外泌体是分泌的囊泡，起源于早期内体向内萌芽进入多泡体（MVB）。然后，MVB与质膜融合，将外泌体释放到细胞外空间以传播到其他细胞3，4。外泌体存在于40至150nm的范围内，并富含称为四泛素（CD9，CD63，CD81）的内体跨膜蛋白，转运所需的膜结合内体分选复合物（ESCRT）和脂筏相关蛋白1，2，5，6，7。
表征外泌体的生化组成已成为研究人员更好地了解其功能性质的热门领域。存在许多用于可视化和表征外泌体的方法，包括纳米级流式细胞术，纳米颗粒跟踪分析（NTA），扫描和透射电子显微镜（TEM），表面等离子体共振，电阻脉冲传感和传统光学显微镜，每种方法都包含固有的优缺点8，9。TEM和冷冻电镜可以达到基于纳米的分辨率，但往往需要脱水和冷冻断裂步骤，从而缩小或裂解EV10、11。NTA依赖于光散射，允许一次表征数百个EV，但是对颗粒尺寸的间接测量，并且不能轻易区分EV，病毒和蛋白质聚集体12，13，14，15，16。纳米级流式细胞术采用来自激发路径的光散射，然后可以将其转换为尺寸测量，但这是一种新兴技术，并且对于各种仪器12，17，18的线性范围内的颗粒大小几乎没有共识。
使用荧光蛋白或染料的传统光学显微镜一直是可视化细胞内亚细胞区室，蛋白质复合物和信号传导机制的最常用技术之一。虽然这种技术被证明在可视化复合物的定位方面是有用的，但传统光学显微镜的衍射极限（约250-400nm）阻止了蛋白质或结构在外泌体（40-150nm）的典型尺寸范围内的清晰分辨率12，19，20。
超分辨率显微镜，即直接随机光学重建显微镜（dSTORM），通过利用特定荧光团的光开关特性并检测这些闪烁事件来重建精度低至纳米精度的图像，从而将自己与传统的光学显微镜区分开来21。在数以万计的单个曝光过程中，使用高帧率检测相机收集光开关事件，并使用点扩散函数以高置信度绘制光开关荧光团19，20，22的确切位置。这使得dSTORM绕过了光学显微镜的衍射极限。几个小组已经报道了使用超分辨率技术来可视化和跟踪外泌体及其相关蛋白质22，23，24，25。最终分辨率取决于荧光团的生物物理性质，但通常沿XY轴的范围为+/-10-100nm，允许单分子分辨率。
在XY轴上以这种尺度分辨单个荧光团的能力已经彻底改变了显微镜。然而，关于外泌体的三维（3-D）dSTORM的数据很少。因此，我们试图建立一种标准操作程序（SOP），用于基于dSTORM的纯化EV的可视化和表征，包括外泌体到3D的纳米精度。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 &#181;-Slide 8 well plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration apparatus</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0142-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Flux S</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0384-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10616D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-cubed buffer</td>
			<td>ONI</td>
			<td>&#160;BCA0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frac 30 Fraction collector</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine pH=2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap CaptoCore 700 Column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17548151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9820003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoimager</td>
			<td>Oxford Nanoimaging</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A797C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flasks</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspek microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris- HCl pH=7.5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn V</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions

细胞外囊泡（EV）由所有细胞类型释放，并在细胞信号传导和体内平衡中起重要作用。电动汽车的可视化通常需要间接方法，因为它们的直径很小（40-250nm），低于典型光学显微镜的衍射极限。我们开发了一种基于超分辨率显微镜的电动汽车可视化，以绕过二维和三维的衍射极限。使用这种方法，我们可以将EV的三维形状解析为XY轴上的+/- 20nm分辨率和沿Z轴的+/- 50nm分辨率。总之，我们建议将超分辨率显微镜视为EV的表征方法，包括外泌体以及包膜病毒。

本研究的目的是评估超分辨率显微镜在三维（3-D）中以纳米分辨率可视化单个电动汽车方面的有效性。为了分析单个EV的形状和大小，我们采用了光开关染料，并用远红色的膜插层染料孵育EV，并通过色谱法29除去多余的染料。然后在640 nm激发激光下在超分辨率显微镜下观察亲和捕获的抗CD81和红色染色的EV。在校准显微镜后，XY轴上产生16 nm的平均误差，Z轴上产生38 nm的平均误差（...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

直接随机光学重建显微镜（dSTORM）用于绕过光学显微镜的典型衍射极限，并在纳米尺度上观察外泌体。它可以在二维和三维空间中用于表征外泌体。

三维细胞外囊泡的直接随机光学重建显微镜

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

该协议采用超分辨率显微镜，特别是直接随机光学重建显微镜，也称为dSTORM，以绕过衍射极限，并在三维空间中以纳米精度可视化EV。dSTORM的一个显着优点是它能够直接可视化光衍射水平下的粒子，而不会破坏改变EV生化性质的步骤。许多进化上不同的病毒采用EV信号传导，因此，dSTORM可用于表征EV的疾病生物标志物和进展，以及可视化单个病毒颗粒，如SARS-CoV2。首先将亲和纯化的细胞外囊泡或EV置于玻璃底，微滑梯，八孔板上，总体积为200微升，并让它们在4摄氏度下粘附在表面上过夜。在不从八孔板中取出现有溶液的情况下，通过将200微升4%多聚甲醛在1X PBS中加入到每个孔中含有EV的溶液中，将EV固定在板上，并允许板在室温下孵育30分钟。用微量移液器小心地去除多聚甲醛和多余的溶液，以免打扰电动汽车。用1X PBS清洗EV以除去多余的多聚甲醛。执行洗涤程序三次。取出多余的 1 倍 PBS。根据制造商的协议，通过在成像缓冲液中稀释的五毫摩尔原儿茶素双加氧酶溶液，为每个样品制备250微升dSTORM Bcubed缓冲液溶液。根据制造商的方案，向每个孔中加入250微升制备的缓冲液，并在成像前在室温下孵育板20分钟以清除氧化分子。电动汽车可以立即可视化或在四摄氏度下储存一周。为了制备超分辨率显微镜校准所需的微珠，将100纳米微球稀释至分子生物学级水中浓度为0.5%，并将200微升移液到玻璃底，微滑梯，八孔板的每个孔中。让珠子在室温下在孔中沉降一小时。在不去除现有溶液的情况下，向校准珠溶液中每个孔中加入200微升PBS中的4%多聚甲醛，并在室温下孵育30分钟。用微量移液管小心地除去多聚甲醛，以免干扰珠子，并用1X PBS洗涤珠子三次。按照手稿中的描述准备缓冲区。除去1X PBS并向每个孔中加入250微升制备的缓冲液。在可视化之前，让缓冲区静置 20 分钟。使用"连接显微镜"按钮连接到3D显微镜，然后再将任何东西放在载物台上。向物镜中加入100X油，并将井的中心放在物镜的顶部。在"采集"设置中，打开 473 纳米和 640 纳米激发激光器，然后单击"查看"。在不激活3D镜头的情况下，通过单击"图像显示选项"中的光子计数，在光子饱和度设置下查看磁珠。对于 473 纳米激光器，将初始激光功率设置为 8.4 毫瓦，对于 640 纳米激光器，将初始激光功率设置为 11.6 毫瓦。将激光的焦点减小到零下300纳米左右或校准微球的焦平面，以产生单个微球的清晰分辨率。Z平面聚焦后，进一步调整激光功率水平，以考虑每个视场的变化。在仪器功能下，完成3D映射校准和通道映射校准，以获得X，Y和Z轴上的误差。在通道映射校准期间，将最大视场数设置为 20，将目标点数设置为 4， 000，将通道之间的最大距离设置为 5.0 像素，将通道之间的排除半径设置为 10.0 像素。确保校准产生的点覆盖率大于90%，并且映射质量良好。保存给定的校准数据，以备将来图像采集。在物镜上加入100X油，然后将准备好的EV放在显微镜上。在不激活3D镜头的情况下，打开640纳米激发激光器，最初将其提高到1.2至12.5毫瓦之间，具体取决于视场中信号的强度，以激发红色膜，插层，染料染色的EV。在"图像显示选项"下，将查看方法从光子饱和度切换到百分位数，以更好地可视化EV。调整激光功率以最小化噪声，同时最大化信号并保持所有其他参数。通过单击 Z 轴上的向上或向下图标来调整 Z 平面的焦点。将曝光时间设置为20毫秒，帧捕获设置为10， 000帧，初始激光功率设置为1.2至12.5毫瓦之间，具体取决于信号强度和视场。使用图标激活3D镜头，然后单击"获取"按钮开始采集。在整个图像采集过程中，将激光功率提高三次，每1000帧提高10次，或足以保持高信噪比。在采集过程中不要调整 Z 平面。图像采集后，切换到"分析"查看窗口。对未过滤的图像执行漂移校正，然后激活滤镜。调整光子计数、定位精度、西格玛和帧索引，如手稿中所述。从视野中沿单个 EV 的 X 轴覆盖 X、Y、Z 平面视图工具，并导出照片切换事件的各个 csv 文件。使用直线直方图工具将X，Y轴上的单个EV一分为X，Y视场，该工具将照片切换事件固定到设置的距离组中。拍摄单个电动汽车的图像并将其另存为tif文件。使用3D可视化工具创建单个EV的3D视频，并根据沿Z轴的位置进行颜色。在对在X，Y轴上产生16纳米和Z轴上产生38纳米平均误差的显微镜进行校准后，纯化的u20s EV在X，Y轴上以高达20纳米的分辨率和沿Z轴的50纳米成功可视化。在3D照片中通过dSTORM可视化的单个EV随着激光功率的增加而在整个10， 000帧曝光期间切换，并且在获得的图像中显而易见。Z平面的采集后图像校正，光子计数，西格玛和重建图像的定位精度使EV在3D中具有清晰的分辨率。EV照片仅在前7， 000帧期间切换，如右上角的图例所示。直方图证实大多数光电开关事件发生在100纳米半径内，验证了可视化的EV是外泌体，并且小直径EV的分离是成功的。使用线直方图工具和X，Y，Z平面视图工具对其他单独跟踪的EV进行尺寸分布分析，确认大多数光开关事件发生在中心半径100纳米范围内。沿Z轴的误差增加，沿轴轴产生EV的细长最终图像。光开关事件与EV大小无关，这表明基于dSTORM的表征可用于小型EV，如外泌体和直径小于100纳米的小型包膜病毒。在执行dSTORM时，重要的是要记住将初始激光功率设置得非常低，并在整个图像采集过程中缓慢提高它，以防止光漂白。自开发以来，dSTORM使研究人员能够更好地了解亚细胞结构的形态，这些结构以前由于典型光学显微镜的衍射极限而无法可视化。

Research

JoVE Journal

Biology

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

相衬，微分干涉对比（DIC）显微镜

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

科研

生物学

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

对于外小泡的使用流式细胞仪分析技术

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

栽培<em&gt;秀丽隐杆线虫</em&gt;在三个维度实验室

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

三维声带振动的半喉设置研究

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

无源清清除小鼠卵巢血管构筑的三维重建

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

2维直接随机光学重建显微成像中间丝和微管

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

细胞调理介质细胞外囊泡的流式细胞学分析

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

卡诺尔哈布炎细胞外囊泡的纯化与分析

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

通过共聚焦显微镜重建单细胞先天荧光特征

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

细胞外囊泡的量化和尺寸测定纳米粒子跟踪分析

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...