Name: direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Vi vil gerne takke Oxford Nanoimaging for deres konstruktive feedback og vejledning. Dette arbejde blev finansieret af 5UM1CA121947-10 til R.P.M. og 1R01DA040394 til D.P.D.

1 Formering og vedligeholdelse af cellelinjer
<ol><li>Erhverve human osteosarcoma celler (U2OS) og placere cellerne i vækstmediet suppleret med 10% exosome-fri Foster kvæg Serum og 1x Penicillin / Streptomycin opløsning. BEMÆRK: Exosome-fri Fosterkvæg Serum blev genereret efter protokollen præsenteret i McNamara et. al.26.</li>
	<li>U2OS-cellerne vedligeholdes i en kobberbelagt inkubator ved 37 °C i 5 % CO2 og passageceller i T175-kolber26,...

Elbiler er blevet et populært studieområde på grund af deres vigtige rolle i mange intracellulære processer og celle-til-celle signalering1,30. Men deres visualisering viser sig at være vanskeligt, da deres lille størrelse falder under diffraktionsgrænsen for lysmikroskopi. Direkte stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (dSTORM) er en direkte metode til visualisering, der omgår diffraktion grænse ved at fange photoswitching begivenheder af individue...

Ekstracellulære vesikler (elbiler) er membranbundne vesikler frigivet af alle celletyper. De indeholder lipider, proteiner, metabolitter og nukleinsyrer og overfører disse materialer lokalt mellem celler og distally mellem væv og organer. Der findes tre primære undertyper af elbiler: apoptotiske kroppe, mikrovesicles og exosomer1,2. Her fokuserer vi vores diskussion på exosomer og deres tilhørende proteiner.
Exosomer er udskilles vesikler stammer fra indad spirende af tidlige endosomes i multivesicular body (MVB). MVB smelter derefter sammen med plasmamembranen og frigiver exosomer i det ekstracellulære rum for at rejse til andre celler3,4. Exosomer findes på et spektrum af størrelser fra 40 til 150 nm og er beriget med endosomal transmembrane proteiner kendt som tetraspaniner (CD9, CD63, CD81), membran-bundet endosomal sortering kompleks kræves til transport (ESCRT), og lipid flåde-associerede proteiner1,2,5,6,7.
Karakterisering af exosomers biokemiske sammensætning er blevet et populært område for forskere til bedre at forstå deres funktionelle natur. Mange metoder findes til visualisering og karakterisering af exosomer, herunder nanoskala flowcytometri, nanopartikler tracking analyse (NTA), scanning og transmission elektron mikroskopi (TEM), overflade plasmon resonans, resistiv puls sensing, og traditionelle lysmikroskopi, som hver indeholder iboende fordele og ulemper8,9. TEM og cryo-EM kan opnå nanometerbaseret opløsning, men kræver ofte dehydrerende og frysefrakturtrin og derved krympe eller lysing af elbiler10,11. NTA er afhængig af lysspredning, der giver mulighed for karakterisering af hundredvis af elbiler ad gangen, men er en indirekte måling af partikelstørrelse og kan ikke let skelne mellem elbiler, vira og proteinaggregater12,13,14,15,16. Nanoskala flowcytometri anvender lysspredning fra en excitationssti, som derefter kan oversættes til størrelsesmålinger, men er en ny teknologi, og der er ringe enighed om, hvilken størrelse partikler der er inden for det lineære område af detektion for forskellige instrumenter12,17,18.
Traditionel lysmikroskopi ved hjælp af fluorescerende proteiner eller farvestoffer har været en af de mest anvendte teknikker til visualisering af subcellulære rum, proteinkomplekser og signalmaskineri i en celle. Mens denne teknik viser sig nyttig til at visualisere lokalisering af komplekser, diffraktion grænse for traditionelle lysmikroskopi (ca. 250-400 nm) forhindrer klar opløsning af proteiner eller strukturer i den typiske størrelse rækkevidde af en exosome (40-150 nm)12,19,20.
Super-opløsning mikroskopi, nemlig direkte stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (dSTORM), adskiller sig fra konventionelle lysmikroskopi ved at anvende photoswitchable egenskaber specifikke fluorophores og opdage disse blinkende begivenheder til at rekonstruere billeder ned til nanometer præcision21. Photoswitching begivenheder indsamles ved hjælp af en høj-framerate detektion kamera i løbet af titusinder af individuelle eksponeringer, og et punkt spredning funktion bruges til at kortlægge med høj tillid den nøjagtige placering af photoswitching fluorophore19,20,22. Dette gør det muligt for dSTORM at omgå diffraktionsgrænsen for lysmikroskopi. Flere grupper har rapporteret brugen af superopløsningsteknikker til visualisering og sporing af exosomer og deres tilknyttede proteiner22,23,24,25. Den endelige opløsning afhænger af fluorophorens biofysiske egenskaber, men varierer ofte fra +/-10-100 nm langs XY-aksen, hvilket giver mulighed for opløsning med enkeltmolekyler.
Evnen til at løse individuelle fluorophorer på denne skala på XY-aksen har revolutioneret mikroskopi. Der er dog kun få data om den tredimensionelle (3D) dSTORM af en exosome. Derfor forsøgte vi at etablere en standardprocedure (SOP) for dSTORM-baseret visualisering og karakterisering af rensede elbiler, herunder exosomer til nanometerpræcision i 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 &#181;-Slide 8 well plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration apparatus</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0142-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Flux S</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0384-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10616D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-cubed buffer</td>
			<td>ONI</td>
			<td>&#160;BCA0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frac 30 Fraction collector</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine pH=2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap CaptoCore 700 Column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17548151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9820003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoimager</td>
			<td>Oxford Nanoimaging</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A797C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flasks</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspek microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris- HCl pH=7.5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn V</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions

Ekstracellulære vesikler (elbiler) frigives af alle celletyper og spiller en vigtig rolle i cellesignalering og homøostase. Visualiseringen af elbiler kræver ofte indirekte metoder på grund af deres lille diameter (40-250 nm), hvilket er under diffraktionsgrænsen for typisk lysmikroskopi. Vi har udviklet en mikroskopibaseret visualisering af elbiler med superopløsning for at omgå diffraktionsgrænsen i både to og tre dimensioner. Ved hjælp af denne tilgang kan vi løse den tredimensionelle form af elbiler til inden for +/- 20 nm opløsning på XY-aksen og +/- 50 nm opløsning langs Z-aksen. Afslutningsvis foreslår vi, at mikroskopi med superopløsning betragtes som en karakteriseringsmetode for elbiler, herunder exosomer, samt indhyllede vira.

Målet med denne undersøgelse var at evaluere effektiviteten af super-opløsning mikroskopi i visualisering af individuelle elbiler med nanometer opløsning i tre dimensioner (3-D). For at analysere formen og størrelsen af de enkelte elbiler, vi ansat photoswitchable farvestof og inkuberet elbiler med en langt rød, membran intercalating farvestof, og fjernet overskydende farvestof gennem kromatografi29. Den affinitet-fanget anti-CD81 og rød-farvede elbiler blev derefter set i super-opløsning ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) bruges til at omgå den typiske diffraktionsgrænse for lysmikroskopi og til at se exosomer på nanometerskalaen. Det kan anvendes i både to og tre dimensioner til at karakterisere exosomer.

Direkte stokastisk optisk rekonstruktion Mikroskopi af ekstracellulære vesikler i tre dimensioner

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Denne protokol anvender mikroskopi i superopløsning, specifikt direkte stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi, også kendt som dSTORM, til at omgå diffraktionsgrænsen og visualisere elbiler med nanometerpræcision i tre dimensioner. En bemærkelsesværdig fordel ved dSTORM er dens evne til direkte at visualisere partikler under diffraktionsniveauet af lys uden skadelige trin, der ændrer ev'ens biokemiske karakter. Mange evolutionært forskellige vira anvender EV signalering, derfor dSTORM kan anvendes til at karakterisere elbiler for sygdom biomarkører og progression, samt at visualisere individuelle viruspartikler, såsom SARS-CoV2. Begynd med at placere affinitetsrensede, ekstracellulære vesikler eller elbiler på glasbund, mikroskred, otte-brøndsplader i et samlet volumen på 200 mikroliter, og lad dem klæbe til overfladen natten over ved fire grader Celsius.Uden at fjerne den eksisterende opløsning fra otte-brøndspladen skal du fastgøre elbiler på pladerne ved at tilsætte 200 mikroliter af 4% paraformaldehyd i 1X PBS til den EV-holdige opløsning i hver brønd og lade pladerne inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt paraformaldehyd og overskydende opløsning med en mikropipette for ikke at forstyrre elbilerne. Vask EV med 1X PBS for at fjerne overskydende paraformaldehyd.Udfør vaskeproceduren tre gange. Fjern overskydende 1X PBS. Klargør 250 mikroliter dSTORM Bcubed bufferopløsning pr. prøve ved at skabe en opløsning af fem millimolar protocatechuic dioxygenase fortyndet i billedbuffer i henhold til producentens protokol.Tilsæt 250 mikroliter af den forberedte buffer til hver såvel som pr. producentens protokol, og inkuber pladerne i 20 minutter ved stuetemperatur før billeddannelse for at skylle oxiderende molekyler. Elbilerne kan visualiseres med det samme eller opbevares ved fire grader Celsius i en uge. For at forberede de perler, der er nødvendige for kalibrering af superopløsningsmikroskopet, fortyndes 100-nanometermikrosfærer til en koncentration på 0,5% i molekylærbiologisk kvalitet vand og pipette 200 mikroliter i hver brønd af en glasbund, mikroslid, otte-brønds plade.Lad perlerne sætte sig i brøndene i en time ved stuetemperatur. Uden at fjerne den eksisterende opløsning tilsættes 200 mikroliter på 4% paraformaldehyd i PBS til hver brønd til kalibreringsperleopløsningen og gør det muligt at inkubere i 30 minutter ved stuetemperatur. Fjern forsigtigt paraformaldehyd med en mikropipette for ikke at forstyrre perlerne, og vask perlerne tre gange med 1X PBS.Forbered bufferen som beskrevet i manuskriptet. Fjern 1X PBS og tilsæt 250 mikroliter af den forberedte buffer til hver brønd. Lad bufferen sidde i 20 minutter før visualisering.Brug knappen Tilslut mikroskopet til at oprette forbindelse til 3D-mikroskopet, før du placerer noget på scenen. Tilsæt 100X olie til målet, og læg midten af brønden oven på målet. I indstillingen Indsending skal du tænde for excitationlaserne 473-og 640 nanometer og klikke på Vis.Uden at aktivere 3D-objektivet kan du se perlerne under indstillingen for fotonmætning ved at klikke på Photon-optællinger i billedvisningsindstillingerne. Indstil de første laserkræfter til 8,4 milliwatt for 473-nanometer laser, og 11,6 milliwatt for 640-nanometer laser. Reducer fokus for laseren til omkring minus 300 nanometer eller brændplan af kalibrering perler til at producere en klar opløsning af de enkelte perler.Når Z-flyet er fokuseret, yderligere justere laser effekt niveauer til at tage højde for variation i hvert synsfelt. Under instrumentfunktionerne skal du fuldføre kalibrering af 3D-kortlægning og kalibrering af kanalkortlægning for at opnå fejlene på X-, Y- og Z-aksen. Angiv det maksimale antal synsfelter til 20, måltallet for punkter til 4.000, den maksimale afstand mellem kanalerne til 5,0 pixel og udelukkelsesradiusen mellem kanalerne til 10,0 pixel under kalibreringen af kanaltilknytningen.Sørg for, at kalibreringen giver en pointdækning på mere end 90 % og kortlægningskvalitet, der er god. Gem de givne kalibreringsdata til fremtidige billedopkøb. Tilsæt 100X olie på målet, og læg de forberedte elbiler på mikroskopet.Uden at aktivere 3D-linsen skal du tænde 640-nanometer excitation laser, og i første omgang hæve den til mellem 1,2 og 12,5 milliwatt, afhængigt af intensiteten af signalet i synsfeltet for at ophidse den røde membran, interskalerende, farvestof-farvede elbiler. Skift visningsmetoden fra fotonmætning til fraktiler under Indstillinger for billedvisning for bedre at kunne visualisere elbilerne. Juster lasereffekten for at minimere støj, samtidig med at signalet maksimeres, og alle andre parametre vedligeholdes.Juster Z-flyets fokus ved at klikke på ikonet op eller ned på Z-aksen. Indstil eksponeringstiden til 20 millisekunder, rammeoptagelsen til 10.000 billeder og den oprindelige lasereffekt til mellem 1,2 og 12,5 milliwatt, afhængigt af signalets intensitet og synsfelt. Aktiver 3D-objektivet ved hjælp af ikonet, og start købet ved at klikke på knappen Indshentning.I hele billedopsamlingsprocessen skal du øge lasereffekten med tre trin på 10 hver 1000 ramme eller nok til at opretholde et højt signal-til-støj-forhold. Juster ikke Z-flyet under erhvervelsen. Når billedopsamlingen er overtaget, skal du skifte til visningsvinduet Analyser.Udfør afdriftskorrektion på det ufiltrerede billede, og aktiver derefter filtre. Juster fotontælling, lokaliseringspræcision, sigmas og rammeindeks, som nævnt i manuskriptet. Overlejre et X- Y, Z-plane-visningsværktøj langs X-aksen af individuelle elbiler fra synsfeltet og eksportere de enkelte csv-filer med photoswitching-hændelser.Tosect individuelle elbiler på X, Y-akse i et X by Y-visningsfelt ved hjælp af et line histogramværktøj, som fastsnævler hændelser i indstillede afstandsgrupper. Tag billeder af enkelte elbiler og gem dem som tif filer. Opret 3D-videoer af individuelle elbiler ved hjælp af et 3D-visualiseringsværktøj og farve i henhold til placering langs Z-aksen.Efter kalibreringen af mikroskopet, der producerede en gennemsnitlig fejl på 16 nanometer på X, Y-aksen og 38 nanometer på Z-aksen, blev de rensede U20s-elbiler med succes visualiseret med en opløsning på op til 20 nanometer på X, Y-aksen og 50 nanometer langs Z-aksen. Individuelle elbiler visualiseret gennem dSTORM i 3D photoswitched hele 10,000 ramme eksponering som laser magt blev øget, og var let synlige i den erhvervede billede. Post-erhvervelse billede korrektion i Z-plan, foton tæller, sigmas, og lokalisering præcision af det rekonstruerede billede resulterede i en klar opløsning af EV i 3D.EV photoswitched i løbet af kun de første 7.000 billeder, som det ses af legenden i øverste højre hjørne. Histogrammet bekræfter, at de fleste photoswitching begivenheder fandt sted inden for en 100-nanometer radius, validere, at den visualiserede EV er en exosome, og at isoleringen af elbiler med en lille diameter var vellykket. Størrelsesfordelingsanalyse udført på andre individuelt sporede elbiler ved hjælp af værktøjet Line Histogram og X, Y, Z-plane View-værktøjet bekræftede, at de fleste photoswitching-hændelser fandt sted inden for en radius af 100 nanometer fra midten.Fejlen langs Z-aksen blev øget, hvilket gav et aflangt endeligt billede af EV langs den aksiale akse. Photoswitching begivenheder var ikke korreleret med EV størrelse, der viser, at dSTORM-baserede karakterisering kan bruges til små elbiler som exosomer og små, indhyllede vira mindre end 100 nanometer i diameter. Mens du udfører dSTORM er det vigtigt at huske at indstille den oprindelige laser magt meget lav, og langsomt hæve det hele billedet erhvervelse for at forhindre photobleaching.Siden sin udvikling har dSTORM gjort det muligt for forskere bedre at forstå morfologien af subcellulære strukturer, der tidligere har været umulige at visualisere på grund af diffraktionsgrænsen for typisk lysmikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker til analyse af ekstracellulær Vesikler anvendelse af flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrkning af<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Hemi-larynx Setup for at studere Vocal Fold vibrationer i tre dimensioner

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Tre-dimensionelle genopbygning af den vaskulære arkitektur i passiv klarhed-ryddet mus æggestokkene

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging mellemliggende filamenter og mikrotubuli med 2-dimensionelle direkte stokastiske optisk genopbygning mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse af ekstracellulære vesikler fra celle-aircondition medier

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensning og analyse af Caenorhabditis elegans Ekstracellulære Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Rekonstruktion af enkeltcellede medfødte fluorescenssignaturer af konfokal mikroskopi

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikler Tracking Analyse for kvantificering og størrelse bestemmelse af ekstracellulære vesikler

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...