Name: direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00
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Wir danken Oxford Nanoimaging für das konstruktive Feedback und die Anleitung. Diese Arbeit wurde durch die 5UM1CA121947-10 an R.P.M. und die 1R01DA040394 an D.P.D. finanziert.

1 Vermehrung und Erhaltung von Zelllinien
<ol><li>Erwerben Sie humane Osteosarkomzellen (U2OS) und legen Sie die Zellen in das Wachstumsmedium, ergänzt mit 10% exosomenfreiem fetalem Rinderserum und 1x Penicillin / Streptomycin-Lösung. HINWEIS: Exosomenfreies fetales Rinderserum wurde nach dem in McNamara et. al.26.</li>
	<li>Halten Sie die U2OS-Zellen in einem kupferbeschichteten Inkubator bei 37 °C in 5% CO2 und Passagezellen in T175-Kolben26,</sup...

EVs sind aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei vielen intrazellulären Prozessen und der Zell-zu-Zell-Signalgebung zueinembeliebten Untersuchungsgebiet geworden 1,30. Ihre Visualisierung erweist sich jedoch als schwierig, da ihre geringe Größe unter die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie fällt. Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) ist eine direkte Visualisierungsmethode, die die Beugungsgrenze umgeht, indem sie Photoschaltereigni...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membrangebundene Vesikel, die von allen Zelltypen freigesetzt werden. Sie enthalten Lipide, Proteine, Metaboliten und Nukleinsäuren und übertragen diese Materialien lokal zwischen Zellen und distal zwischen Geweben und Organen. Es gibt drei primäre Subtypen von EVs: apoptotische Körper, Mikrovesikel und Exosomen1,2. Hier konzentrieren wir unsere Diskussion auf Exosomen und ihre assoziierten Proteine.
Exosomen sind sezernierte Vesikel, die aus dem nach innen gerichteten Austrieb früher Endosomen in den multivesikulären Körper (MVB) stammen. Das MVB verschmilzt dann mit der Plasmamembran und setzt die Exosomen in den extrazellulären Raum frei, um zu anderen Zellen zu gelangen3,4. Exosomen existieren in einem Spektrum von Größen von 40 bis 150 nm und sind angereichert mit endosomalen Transmembranproteinen, die als Tetraspanine (CD9, CD63, CD81), membrangebundener endosomaler Sortierkomplex, der für den Transport erforderlich ist (ESCRT), und Lipid-Raft-assoziierten Proteinen1,2,5,6,7.
Die Charakterisierung der biochemischen Zusammensetzung von Exosomen ist zu einem beliebten Feld für Forscher geworden, um ihre funktionelle Natur besser zu verstehen. Es gibt viele Methoden zur Visualisierung und Charakterisierung von Exosomen, einschließlich nanoskaliger Durchflusszytometrie, Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA), Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Oberflächenplasmonresonanz, resistiver Pulserfassung und traditioneller Lichtmikroskopie, von denen jede intrinsische Vor- und Nachteileenthält 8,9. TEM und Kryo-EM können eine nanometerbasierte Auflösung erreichen, erfordern jedoch häufig Dehydratisierungs- und Gefrierbruchschritte, wodurch EVs10,11geschrumpft oder lysiert werden. NTA beruht auf Lichtstreuung, die die Charakterisierung von Hunderten von EVs gleichzeitig ermöglicht, ist aber eine indirekte Messung der Partikelgröße und kann nicht leicht zwischen EVs, Viren und Proteinaggregatenunterscheiden 12,13,14,15,16. Die nanoskalige Durchflusszytometrie verwendet Lichtstreuung aus einem Anregungspfad, der dann in Größenmessungen übersetzt werden kann, ist aber eine aufkommende Technologie, und es gibt wenig Konsens darüber, welche Größe der Partikel innerhalb des linearen Detektionsbereichs für verschiedene Instrumente12,17,18 liegt.
Die traditionelle Lichtmikroskopie mit fluoreszierenden Proteinen oder Farbstoffen war eine der am häufigsten eingesetzten Techniken zur Visualisierung subzellulärer Kompartimente, Proteinkomplexe und Signalmaschinen innerhalb einer Zelle. Während sich diese Technik bei der Visualisierung der Lokalisation von Komplexen als nützlich erweist, verhindert die Beugungsgrenze der traditionellen Lichtmikroskopie (etwa 250-400 nm) die klare Auflösung von Proteinen oder Strukturen im typischen Größenbereich eines Exosoms (40-150 nm)12,19,20.
Die hochauflösende Mikroskopie, nämlich die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM), unterscheidet sich von der konventionellen Lichtmikroskopie dadurch, dass sie die photoschaltbaren Eigenschaften bestimmter Fluorophore nutzt und diese blinkenden Ereignisse detektiert, um Bilder bis zu einer Nanometergenauigkeit zu rekonstruieren21. Photoswitching-Ereignisse werden mit einer Kamera mit hoher Bildrate im Verlauf von Zehntausenden von Einzelbelichtungen gesammelt, und eine Punktspreizfunktion wird verwendet, um den genauen Standort des photoswitching Fluorophors19,20 , 22mithoher Sicherheitabzubilden. Dadurch kann dSTORM die Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie umgehen. Mehrere Gruppen haben über die Verwendung von hochauflösenden Techniken zur Visualisierung und Verfolgung von Exosomen und ihren assoziierten Proteinen berichtet22,23,24,25. Die endgültige Auflösung hängt von den biophysikalischen Eigenschaften des Fluorophors ab, liegt aber oft zwischen +/-10-100 nm entlang der XY-Achse, was eine Einzelmolekülauflösung ermöglicht.
Die Fähigkeit, einzelne Fluorophore in dieser Größenordnung auf der XY-Achse aufzulösen, hat die Mikroskopie revolutioniert. Es gibt jedoch nur wenige Daten über den dreidimensionalen (3-D) dSTORM eines Exosoms. Daher haben wir versucht, eine Standardarbeitsanweisung (SOP) für die dSTORM-basierte Visualisierung und Charakterisierung von gereinigten Elektrofahrzeugen, einschließlich Exosomen mit Nanometer-Genauigkeit in 3-D, zu etablieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 &#181;-Slide 8 well plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration apparatus</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0142-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Flux S</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0384-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10616D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-cubed buffer</td>
			<td>ONI</td>
			<td>&#160;BCA0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frac 30 Fraction collector</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine pH=2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap CaptoCore 700 Column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17548151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9820003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoimager</td>
			<td>Oxford Nanoimaging</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A797C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flasks</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspek microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris- HCl pH=7.5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn V</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions

Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden von allen Zelltypen freigesetzt und spielen eine wichtige Rolle bei der Zellsignalisierung und Homöostase. Die Visualisierung von EVs erfordert aufgrund ihres geringen Durchmessers (40-250 nm), der unterhalb der Beugungsgrenze der typischen Lichtmikroskopie liegt, oft indirekte Methoden. Wir haben eine hochauflösende mikroskopiebasierte Visualisierung von Elektrofahrzeugen entwickelt, um die Beugungsgrenze sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen zu umgehen. Mit diesem Ansatz können wir die dreidimensionale Form von Elektrofahrzeugen auf eine Auflösung von +/- 20 nm auf der XY-Achse und eine Auflösung von +/- 50 nm entlang der Z-Achse auflösen. Zusammenfassend schlagen wir vor, dass die hochauflösende Mikroskopie als Charakterisierungsmethode für EVs, einschließlich Exosomen, sowie von behüllten Viren betrachtet wird.

Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit der hochauflösenden Mikroskopie bei der Visualisierung einzelner EVs mit Nanometerauflösung in drei Dimensionen (3-D) zu bewerten. Um die Form und Größe einzelner EVs zu analysieren, verwendeten wir photosschaltbaren Farbstoff und inkubierten die EVs mit einem fernroten, membraninterkalierenden Farbstoff und entfernten überschüssigen Farbstoff durch Chromatographie29. Die affinitätsgefangenen Anti-CD81- und rotgefärbten EVs wurden dann im hochaufl...

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Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Die direkt stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) wird verwendet, um die typische Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie zu umgehen und Exosomen auf der Nanometerskala zu betrachten. Es kann sowohl in zwei als auch in drei Dimensionen eingesetzt werden, um Exosomen zu charakterisieren.

Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Dieses Protokoll verwendet hochauflösende Mikroskopie, insbesondere direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie, auch bekannt als dSTORM, um die Beugungsgrenze zu umgehen und EVs mit Nanometergenauigkeit in drei Dimensionen zu visualisieren. Ein bemerkenswerter Vorteil von dSTORM ist seine Fähigkeit, Partikel direkt unterhalb der Beugungsstufe des Lichts zu visualisieren, ohne die Schritte zu beschädigen, die die biochemische Natur des EV verändern. Viele evolutionär unterschiedliche Viren verwenden EV-Signale, daher kann dSTORM verwendet werden, um EVs für Krankheitsbiomarker und Progression zu charakterisieren sowie einzelne Viruspartikel wie SARS-CoV2 zu visualisieren. Beginnen Sie mit dem Platzieren von affinitätsgereinigten, extrazellulären Vesikeln oder EVs auf Glasboden-Mikrorutschen-Acht-Well-Platten in einem Gesamtvolumen von 200 Mikrolitern und lassen Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius an der Oberfläche haften.Ohne die vorhandene Lösung von der Acht-Well-Platte zu entfernen, befestigen Sie EVs auf den Platten, indem Sie 200 Mikroliter 4% Paraformaldehyd in 1X PBS in die EV-haltige Lösung in jeder Vertiefung geben und die Platten 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Entfernen Sie Paraformaldehyd und überschüssige Lösung vorsichtig mit einer Mikropipette, um die EVs nicht zu stören. Waschen Sie das EV mit 1X PBS, um überschüssiges Paraformaldehyd zu entfernen.Führen Sie den Waschvorgang dreimal durch. Entfernen Sie überschüssige 1X PBS. Bereiten Sie 250 Mikroliter dSTORM Bcubed-Pufferlösung pro Probe vor, indem Sie eine Lösung aus fünf Millimolarer protokatakräischer Dioxygenase erzeugen, die gemäß dem Protokoll des Herstellers in Bildpuffer verdünnt wird.Fügen Sie 250 Mikroliter des vorbereiteten Puffers zu jeder Vertiefung gemäß dem Protokoll des Herstellers hinzu und inkubieren Sie die Platten für 20 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie sich vorstellen, um oxidierende Moleküle abzufangen. Die EVs können sofort visualisiert oder eine Woche lang bei vier Grad Celsius gelagert werden. Um die für die Kalibrierung des hochauflösenden Mikroskops erforderlichen Kügelchen vorzubereiten, verdünnen Sie 100-Nanometer-Mikrokugeln auf eine Konzentration von 0,5% in molekularbiologischem Wasser und pipettieren Sie 200 Mikroliter in jede Vertiefung einer Glasboden-, Mikrorutschen- und Acht-Well-Platte.Lassen Sie die Perlen bei Raumtemperatur eine Stunde lang in den Vertiefungen absetzen. Ohne die vorhandene Lösung zu entfernen, geben Sie 200 Mikroliter 4% Paraformaldehyd in PBS zu jeder Vertiefung in die Kalibrierperlenlösung und lassen Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie das Paraformaldehyd vorsichtig mit einer Mikropipette, um die Perlen nicht zu stören, und waschen Sie die Perlen dreimal mit 1X PBS.Bereiten Sie den Puffer wie im Manuskript beschrieben vor. Entfernen Sie 1X PBS und fügen Sie 250 Mikroliter des vorbereiteten Puffers zu jeder Vertiefung hinzu. Lassen Sie den Puffer vor der Visualisierung 20 Minuten ruhen.Verwenden Sie die Taste Mikroskop anschließen, um eine Verbindung zum 3D-Mikroskop herzustellen, bevor Sie etwas auf die Bühne stellen. Fügen Sie dem Objektiv 100X Öl hinzu und platzieren Sie die Mitte des Bohrlochs auf dem Objektiv. Schalten Sie in der Einstellung Erfassen die 473- und 640-Nanometer-Anregungslaser ein und klicken Sie auf Ansicht.Ohne das 3D-Objektiv zu aktivieren, können Sie die Perlen unter der Einstellung für die Photonensättigung anzeigen, indem Sie in den Bildanzeigeoptionen auf Photonenanzahl klicken. Stellen Sie die anfängliche Laserleistung auf 8,4 Milliwatt für den 473-Nanometer-Laser und 11,6 Milliwatt für den 640-Nanometer-Laser ein. Verringern Sie den Fokus des Lasers auf etwa minus 300 Nanometer oder die Brennebene der Kalibrierperlen, um eine klare Auflösung der einzelnen Kügelchen zu erzeugen.Sobald die Z-Ebene fokussiert ist, passen Sie die Laserleistungspegel weiter an, um Schwankungen in jedem Sichtfeld zu berücksichtigen. Führen Sie unter den Gerätefunktionen die 3D-Mapping-Kalibrierung und die Kanal-Mapping-Kalibrierung durch, um die Fehler auf der X-, Y- und Z-Achse zu erhalten. Legen Sie die maximale Anzahl der Sichtfelder auf 20, die Zielanzahl der Punkte auf 4.000, den maximalen Abstand zwischen den Kanälen auf 5,0 Pixel und den Ausschlussradius zwischen den Kanälen auf 10,0 Pixel während der Kanalzuordnungskalibrierung fest.Stellen Sie sicher, dass die Kalibrierung eine Punktabdeckung von mehr als 90 % und eine gute Mapping-Qualität liefert. Speichern Sie die angegebenen Kalibrierdaten für zukünftige Bildaufnahmen. Fügen Sie 100X Öl auf das Objektiv hinzu und legen Sie die vorbereiteten EVs auf das Mikroskop.Ohne die 3D-Linse zu aktivieren, schalten Sie den 640-Nanometer-Anregungslaser ein und erhöhen Sie ihn zunächst auf 1,2 bis 12,5 Milliwatt, abhängig von der Intensität des Signals im Sichtfeld, um die rote Membran anzuregen, interkalierende, farbstoffgefärbte EVs. Wechseln Sie unter Bildanzeigeoptionen die Anzeigemethode von Photonensättigung zu Perzentilen, um die EVs besser zu visualisieren. Passen Sie die Laserleistung an, um das Rauschen zu minimieren und gleichzeitig das Signal zu maximieren und alle anderen Parameter beizubehalten.Passen Sie den Fokus der Z-Ebene an, indem Sie auf das Aufwärts- oder Abwärtssymbol auf der Z-Achse klicken. Stellen Sie die Belichtungszeit auf 20 Millisekunden, die Bildaufnahme auf 10.000 Bilder und die anfängliche Laserleistung auf 1,2 bis 12,5 Milliwatt ein, abhängig von der Intensität des Signals und dem Sichtfeld. Aktivieren Sie das 3D-Objektiv über das Symbol und starten Sie die Erfassung, indem Sie auf die Schaltfläche Erwerben klicken.Erhöhen Sie während des gesamten Bildaufnahmeprozesses die Laserleistung um drei Schritte von 10 alle 1000 Frames oder genug, um ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufrechtzuerhalten. Stellen Sie die Z-Ebene während der Erfassung nicht ein. Wechseln Sie nach der Bildaufnahme zum Anzeigefenster Analysieren.Führen Sie eine Driftkorrektur für das ungefilterte Bild durch, und aktivieren Sie dann Filter. Passen Sie photonenzahl, Lokalisierungsgenauigkeit, Sigmas und Rahmenindex an, wie im Manuskript erwähnt. Überlagern Sie ein X-, Y-, Z-Ebenen-Ansichtswerkzeug entlang der X-Achse einzelner EVs aus dem Sichtfeld und exportieren Sie die einzelnen CSV-Dateien von Photoswitching-Ereignissen.Halbieren Sie einzelne EVs auf der X-, Y-Achse in einem X-by-Y-Sichtfeld mit einem Linienhistogramm-Werkzeug, das Fotoschaltereignisse in festgelegte Entfernungsgruppen einfügt. Nehmen Sie Bilder von einzelnen Elektrofahrzeugen auf und speichern Sie sie als tif-Dateien. Erstellen Sie 3D-Videos einzelner EVs mit einem 3D-Visualisierungswerkzeug und Farben entsprechend der Platzierung entlang der Z-Achse.Nach der Kalibrierung des Mikroskops, das einen durchschnittlichen Fehler von 16 Nanometern auf der X-, Y-Achse und 38 Nanometern auf der Z-Achse ergab, wurden die gereinigten u20s-EVs erfolgreich mit einer Auflösung von bis zu 20 Nanometern auf der X-, Y-Achse und 50 Nanometern entlang der Z-Achse visualisiert. Einzelne EVs, die durch dSTORM in 3D-Fotos visualisiert wurden, die während der gesamten Belichtung mit 10.000 Bildern geschaltet wurden, als die Laserleistung erhöht wurde, und waren im aufgenommenen Bild leicht sichtbar. Die Bildkorrektur nach der Aufnahme in der Z-Ebene, Photonenzähler, Sigmas und Lokalisierungspräzision des rekonstruierten Bildes führten zu einer klaren Auflösung des EV in 3D.Die EV-Fotos wurden nur während der ersten 7.000 Frames umgeschaltet, wie die Legende in der oberen rechten Ecke zeigt. Das Histogramm bestätigt, dass die Mehrheit der Photoschaltereignisse innerhalb eines Radius von 100 Nanometern stattfand, was bestätigt, dass das visualisierte EV ein Exosom ist und dass die Isolierung von EVs mit kleinem Durchmesser erfolgreich war. Die Größenverteilungsanalyse, die an anderen einzeln verfolgten Elektrofahrzeugen mit dem Linienhistogramm-Werkzeug und dem X-, Y-, Z-Ebene-Ansichtswerkzeug durchgeführt wurde, bestätigte, dass die meisten Photo-Schaltereignisse in einem Umkreis von 100 Nanometern um das Zentrum auftraten.Der Fehler entlang der Z-Achse wurde erhöht, wodurch ein längliches Endbild des EV entlang der axialen Achse erzeugt wurde. Photoswitching-Ereignisse korrelierten nicht mit der EV-Größe, was zeigt, dass dSTORM-basierte Charakterisierung für kleine EVs wie Exosomen und kleine, behüllte Viren mit einem Durchmesser von weniger als 100 Nanometern verwendet werden kann. Während der Durchführung von dSTORM ist es wichtig, daran zu denken, die anfängliche Laserleistung sehr niedrig einzustellen und sie während der gesamten Bildaufnahme langsam zu erhöhen, um Photobleichen zu verhindern.Seit seiner Entwicklung hat dSTORM es den Forschern ermöglicht, die Morphologie subzellulärer Strukturen besser zu verstehen, die aufgrund der Beugungsgrenze der typischen Lichtmikroskopie bisher nicht sichtbar waren.

Research

JoVE Journal

Biology

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

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Forschung

Biologie

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Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

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der Anbau von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; In drei Dimensionen im Labor

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Dreidimensionale Rekonstruktion der vaskulären Architektur des Eierstocks Passive Klarheit geclearte Maus

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Imaging-Intermediate Filamenten und Mikrotubuli mit 2-dimensionale direkte stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie

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Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

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Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

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Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

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