Name: direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00
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हम ऑक्सफोर्ड नैनोइमेजिंग को उनकी रचनात्मक प्रतिक्रिया और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस कार्य को 5UM1CA121947-10 से आर.पी. .M और 1R01DA040394 से डी.पी.डी.

1 सेल लाइनों का प्रचार और रखरखाव
<ol><li>मानव ऑस्टियोसारकोमा कोशिकाओं (U2OS) का अधिग्रहण करें और कोशिकाओं को 10% एक्सोसोम-मुक्त भ्रूण गोजातीय सीरम और 1x पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक विकास माध्?...

ईवीएस कई इंट्रासेलुलर प्रक्रियाओं और सेल-टू-सेल सिग्नलिंग1,30में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका के कारण अध्ययन का एक लोकप्रिय क्षेत्र बन गया है। हालांकि, उनका विज़ुअलाइज़ेशन मुश्किल सा?...

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) सभी सेल प्रकारों द्वारा जारी झिल्ली-बाध्य वेसिकल्स हैं। इनमें लिपिड, प्रोटीन, मेटाबोलाइट्स और न्यूक्लिक एसिड होते हैं और इन सामग्रियों को स्थानीय रूप से कोशिकाओं के बीच और ऊतकों और अंगों के बीच डिस्टली स्थानांतरित करते हैं। ईवीएस के तीन प्राथमिक उपप्रकार हैं: एपोटोटिक निकाय, माइक्रोवेसिकल्स, और एक्सोसोम1,2। यहां, हम एक्सोसोम्स और उसके जुड़े प्रोटीन पर अपनी चर्चा केंद्रित करते हैं।
एक्सोसोम्स को मल्टीवेस्कुलर बॉडी (एमवीबी) में शुरुआती एंडोसोम्स के आवक नवोदित से निकलने वाले वेसिकल्स को स्रावित किया जाता है। एमवीबी तब प्लाज्मा झिल्ली के साथ फ़्यूज़ करता है, जो एक्सोसोम्स को अन्य कोशिकाओं3,4की यात्रा करने के लिए बाह्य अंतरिक्ष में जारी करता है। एक्सोसोम 40 से 150 एनएम तक के आकारों के स्पेक्ट्रम पर मौजूद होते हैं और एंडोसोमल ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन से समृद्ध होते हैं जिसे टेट्रास्पैनिन (सीडी 9, सीडी 63, सीडी 81), परिवहन (ईएससीआरटी) के लिए आवश्यक झिल्ली-बाध्य एंडोसोमल छंटाई परिसर और लिपिड बेड़ा से जुड़े प्रोटीन1,2,5,6, 7के रूप में जानाजाताहै।
एक्सोसोम्स के बायोकेमिकल मेकअप की विशेषता शोधकर्ताओं के लिए उनके कार्यात्मक स्वभाव को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक लोकप्रिय क्षेत्र बन गया है । नैनोस्केल फ्लो साइटोमेट्री, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए), स्कैनिंग और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएमई), सरफेस प्लाजन अनुनाद, प्रतिरोधी पल्स सेंसिंग और पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी सहित एक्सोसोम्स की कल्पना और विशेषता के लिए कई विधियां मौजूद हैं, जिनमें से प्रत्येक में आंतरिक पेशेवरों और विपक्ष8,9शामिल हैं। TEM और क्रायो-ईएम नैनोमीटर आधारित संकल्प प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन अक्सर निर्जलीकरण और फ्रीज-फ्रैक्चर चरणों की आवश्यकता होती है, जिससे ईवी10, 11सिकुड़ या lysing होता है। एनटीए प्रकाश बिखरने पर निर्भर करता है, जो एक समय में सैकड़ों ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, लेकिन कणों के आकार का एक अप्रत्यक्ष माप है और आसानी से ईवीएस, वायरस और प्रोटीन के बीच अंतर नहीं कर सकता है12,13, 14,15,16। नैनोस्केल प्रवाह साइटोमेट्री एक उत्तेजन पथ से प्रकाश बिखरने को नियोजित करता है, जिसे तब आकार माप में अनुवादित किया जा सकता है, लेकिन एक उभरती हुई तकनीक है, और विभिन्न उपकरणों12,17,18के लिए पता लगाने की रैखिक सीमा के भीतर कणों का आकार क्याहै,इस पर बहुत कम आम सहमति है।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन या रंगों का उपयोग करके पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी एक कोशिका के भीतर उपकोशिकीय डिब्बों, प्रोटीन परिसरों और सिग्नलिंग मशीनरी की कल्पना करने के लिए सबसे भारी नियोजित तकनीकों में से एक रही है। हालांकि यह तकनीक परिसरों के स्थानीयकरण की कल्पना करने में उपयोगी साबित होती है, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी (लगभग 250-400 एनएम) की विवर्तन सीमा एक एक्सोसोम (40-150 एनएम)12,19,20की विशिष्ट आकार सीमा में प्रोटीन या संरचनाओं के स्पष्ट समाधान को रोकती है।
सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, अर्थात्, प्रत्यक्ष स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (dSTORM), विशिष्ट फ्लोरोफोरस के फोटोस्विचेबल गुणों को नियोजित करके पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी से खुद को अलग करता है और नैनोमीटर सटीक21के नीचे छवियों को पुनर्निर्मित करने के लिए इन निमिष घटनाओं का पता लगाता है। फोटोस्विचिंग घटनाओं को दसियों हजार व्यक्तिगत एक्सपोजर के दौरान एक उच्च-फ्रेमरेट डिटेक्शन कैमरे का उपयोग करके एकत्र किया जाता है, और एक बिंदु प्रसार फ़ंक्शन का उपयोगफोटोस्विचिंग फ्लोरोफोर19,20, 22के सटीक स्थान को उच्च आत्मविश्वास के साथ मैप करने के लिए कियाजाताहै। यह dstorm प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा को बाईपास करने की अनुमति देता है। कई समूहों ने एक्सोसोम्स और 22 ,23 , 24 , 25के विशेषज्ञों और 22,23 , 24,25को कल्पना करने और ट्रैक करने के लिए सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकोंकेउपयोग की सूचना दी है। अंतिम संकल्प फ्लोरोफोर के जैव भौतिक गुणों पर निर्भर करता है, लेकिन अक्सर XY-अक्ष के साथ +/-10-100 एनएम से लेकर होता है, जिससे एकल अणु संकल्प की अनुमति होती है ।
XY-धुरी पर इस पैमाने पर व्यक्तिगत फ्लोरोफोरस को हल करने की क्षमता ने माइक्रोस्कोपी में क्रांति ला दी है। हालांकि, एक एक्सोसोम के त्रि-आयामी (3-डी) dSTORM पर थोड़ा डेटा है। इसलिए, हमने 3-डी में नैनोमीटर परिशुद्धता के लिए एक्सोसोम सहित डीस्टॉर्म-आधारित विज़ुअलाइज़ेशन और शुद्ध ईवीएस के लक्षण वर्णन के लिए एक मानक ऑपरेटिंग प्रक्रिया (एसओपी) स्थापित करने की मांग की।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 &#181;-Slide 8 well plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration apparatus</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0142-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Flux S</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0384-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10616D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-cubed buffer</td>
			<td>ONI</td>
			<td>&#160;BCA0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frac 30 Fraction collector</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine pH=2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap CaptoCore 700 Column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17548151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9820003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoimager</td>
			<td>Oxford Nanoimaging</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A797C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flasks</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspek microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris- HCl pH=7.5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn V</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) सभी सेल प्रकारों द्वारा जारी किए जाते हैं और सेल सिग्नलिंग और होमोस्टेसिस में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। ईवीएस के दृश्य के लिए अक्सर उनके छोटे व्यास (40-250 एनएम) के कारण अप्रत्यक्ष तरीकों की आवश्यकता होती है, जो विशिष्ट प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा के नीचे है। हमने दो और तीन आयामों दोनों में विवर्तन सीमा को दरकिनार करने के लिए ईवीएस का एक सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी-आधारित दृश्य विकसित किया है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम जेड-एक्सिस के साथ XY-धुरी और +/-50 एनएम संकल्प पर +/-20 एनएम संकल्प के भीतर ईवीएस के त्रि-आयामी आकार को हल कर सकते हैं । अंत में, हम प्रस्ताव करते हैं कि सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को ईवीएस की लक्षण वर्णन विधि के रूप में माना जाए, जिसमें एक्सोसोम्स के साथ-साथ छा जाने वाले वायरस भी शामिल हैं।

इस अध्ययन का लक्ष्य तीन आयामों (3-डी) में नैनोमीटर संकल्प के साथ व्यक्तिगत ईवीएस की कल्पना करने में सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करना था। व्यक्तिगत ईवी के आकार और आकार का...

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Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

प्रत्यक्ष स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (dSTORM) का उपयोग प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विशिष्ट विवर्तन सीमा को बाईपास करने और नैनोमीटर पैमाने पर एक्सोसोम्स को देखने के लिए किया जाता है। यह एक्सोसोम्स की विशेषता के लिए दो और तीन दोनों आयामों में नियोजित किया जा सकता है।

तीन आयामों में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स की डायरेक्ट स्टोचस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

यह प्रोटोकॉल सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी को नियोजित करता है, विशेष रूप से सीधे स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी, जिसे डीस्टॉर्म के नाम से भी जाना जाता है, विवर्तन सीमा को बाईपास करने और तीन आयामों में नैनोमीटर परिशुद्धता के साथ ईवीएस की कल्पना करने के लिए। dSTORM का एक उल्लेखनीय लाभ यह है कि ईवी के जैव रासायनिक प्रकृति को बदलने वाले हानिकारक कदमों के बिना प्रकाश के विवर्तन स्तर के नीचे कणों को सीधे कल्पना करने की क्षमता है। कई विकासवादी अलग-अलग वायरस ईवी सिग्नलिंग को नियोजित करते हैं, इसलिए, रोग बायोमार्कर और प्रगति के लिए ईवी की विशेषता के साथ-साथ सार्स-CoV2 जैसे व्यक्तिगत वायरस कणों की कल्पना करने के लिए dSTORM को नियोजित किया जा सकता है। 200 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में एफ़िनिटी-शुद्ध, एक्सपेरिमेंटल वेसिकल्स या ईवीएस, ग्लास-बॉटम, माइक्रोस्लाइड, आठ-वेल प्लेटों पर रखकर शुरू करें, और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर सतह का पालन करने की अनुमति दें।आठ-अच्छी प्लेट से मौजूदा समाधान को हटाने के बिना, प्रत्येक कुएं में ईवी-युक्त समाधान में 1X पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 200 माइक्रोलीटर जोड़कर प्लेटों पर ईवीएस को ठीक करें और प्लेटों को कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। ईवीएस को परेशान न करने के लिए माइक्रोपिपेट के साथ पैराफॉर्मेल्डिहाइड और अतिरिक्त समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें। अतिरिक्त पैराफॉर्मलडिहाइड को हटाने के लिए 1X पीबीएस के साथ ईवी धोएं।तीन बार वॉश प्रक्रिया करें। अतिरिक्त 1X पीबीएस निकालें। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार इमेजिंग बफर में पतला पांच मिलीमोलर प्रोटोकेटेचिक डाइऑक्सिजन का समाधान बनाकर प्रति नमूना डीस्टॉर्म बीसीयूबी बफर सॉल्यूशन के 250 माइक्रोलीटर तैयार करें।निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक के लिए तैयार बफर के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें, और ऑक्सीकरण अणुओं को मैला करने के लिए इमेजिंग से पहले कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। ईवीएस को तुरंत कल्पना की जा सकती है या एक सप्ताह के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोप के अंशांकन के लिए आवश्यक मोतियों को तैयार करने के लिए, आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी में 0.5% की एकाग्रता के लिए 100-नैनोमीटर माइक्रोस्फीयर को पतला करें, और एक ग्लास-बॉटम, माइक्रोस्लाइड, आठ-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में पिपेट 200 माइक्रोलीटर।मोती कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए कुओं में बसने के लिए अनुमति दें । मौजूदा समाधान को हटाने के बिना, PBS में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 200 माइक्रोलीटर को अंशांकन मनका समाधान के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। मोतियों को परेशान न करने के लिए माइक्रोपिपेट के साथ पैराफॉर्मेल्डिहाइड को सावधानी से हटा दें, और मोतियों को 1X पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।पांडुलिपि में वर्णित बफर तैयार करें। 1X पीबीएस निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से तैयार बफर के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें। बफर को विजुअलाइजेशन से पहले 20 मिनट तक बैठने दें।स्टेज पर कुछ भी रखने से पहले 3डी माइक्रोस्कोप से कनेक्ट करने के लिए कनेक्ट माइक्रोस्कोप बटन का इस्तेमाल करें। उद्देश्य के लिए 100X तेल जोड़ें, और उद्देश्य के शीर्ष पर अच्छी तरह से केंद्र जगह है । अधिग्रहण सेटिंग में, 473-और 640-नैनोमीटर उत्तेजन लेजर चालू करें और देखें पर क्लिक करें।3डी लेंस को सक्रिय किए बिना, इमेज डिस्प्ले विकल्पों में फोटॉन काउंट पर क्लिक करके फोटॉन संतृप्ति सेटिंग के तहत मोतियों को देखें। 473-नैनोमीटर लेजर के लिए 8.4 मिलीवाट के लिए प्रारंभिक लेजर शक्तियों सेट करें, और 640-नैनोमीटर लेजर के लिए 11.6 मिलीवाट। लेजर का ध्यान घटाकर लगभग शून्य से 300 नैनोमीटर या अंशांकन मोतियों के फोकल प्लेन व्यक्तिगत मोतियों का स्पष्ट समाधान प्रस्तुत करें।एक बार जेड विमान ध्यान केंद्रित है, आगे लेजर शक्ति के स्तर को समायोजित करने के लिए प्रत्येक क्षेत्र के देखने में भिन्नता के लिए खाते । इंस्ट्रूमेंट कार्यों के तहत, एक्स, वाई और जेड-एक्सिस पर त्रुटियों को प्राप्त करने के लिए 3डी मैपिंग अंशांकन और चैनल मैपिंग अंशांकन पूरा करें। फ़ील्ड-ऑफ-व्यू की अधिकतम संख्या को 20 तक सेट करें, अंकों की लक्ष्य संख्या 4, 000, चैनलों के बीच अधिकतम दूरी 5.0 पिक्सल तक, और चैनल मैपिंग अंशांकन के दौरान चैनलों के बीच 10.0 पिक्सल तक अपवर्जन त्रिज्या।सुनिश्चित करें कि अंशांकन 90% से अधिक और मानचित्रण गुणवत्ता का एक बिंदु कवरेज पैदा करता है जो अच्छा है। भविष्य की छवि अधिग्रहण के लिए दिए गए अंशांकन डेटा को सहेजें। उद्देश्य पर 100X तेल जोड़ें, और माइक्रोस्कोप पर तैयार EVs जगह है ।3 डी लेंस को सक्रिय किए बिना, 640-नैनोमीटर उत्तेजन लेजर चालू करें, और शुरू में इसे 1.2 और 12.5 मिलीवाट के बीच बढ़ाएं, जो लाल झिल्ली, इंटरकैलिट, डाई-दाग ईवीएस को उत्तेजित करने के लिए क्षेत्र-दृश्य में सिग्नल की तीव्रता के आधार पर है। इमेज डिस्प्ले ऑप्शंस के तहत, ईवीएस को बेहतर तरह से कल्पना करने के लिए फोटॉन सैचुरेशन से परसेंटाइल में देखने की विधि को स्विच करें। सिग्नल को अधिकतम करते हुए शोर को कम करने और अन्य सभी मापदंडों को बनाए रखने के लिए लेजर पावर को समायोजित करें।जेड-एक्सिस पर अप या डाउन आइकन पर क्लिक करके जेड-प्लेन का फोकस एडजस्ट करें। सिग्नल और फील्ड-ऑफ-व्यू की तीव्रता के आधार पर 20 मिलीसेकंड के लिए एक्सपोजर समय निर्धारित करें, 10, 000 फ्रेम पर फ्रेम कैप्चर करें, और प्रारंभिक लेजर पावर 1.2 और 12.5 मिलीवाट के बीच हो। आइकन का उपयोग करके 3डी लेंस को सक्रिय करें, और अधिग्रहण बटन पर क्लिक करके अधिग्रहण शुरू करें।छवि अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान, लेजर पावर को हर 1000 फ्रेम में 10 की तीन वेतन वृद्धि द्वारा बढ़ाएं, या उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात को बनाए रखने के लिए पर्याप्त है। अधिग्रहण के दौरान जेड-प्लेन को एडजस्ट न करें। छवि अधिग्रहण के बाद, विश्लेषण देखने खिड़की पर टॉगल।अनफ़िल्टर्ड छवि पर बहाव सुधार करें, और फिर फ़िल्टर को सक्रिय करें। पांडुलिपि में उल्लिखित फोटॉन काउंट, लोकलाइजेशन सटीकता, सिग्मास और फ्रेम इंडेक्स को समायोजित करें। क्षेत्र के दृश्य से व्यक्तिगत ईवीएस के एक्स-एक्सिस के साथ एक्स, वाई, जेड-प्लेन व्यू टूल को ओवरले करें और फोटोस्विचिंग घटनाओं की व्यक्तिगत सीएसवी फाइलों का निर्यात करें।एक्स पर व्यक्तिगत ईवीएस, वाई-एक्सिस एक एक्स में वाई फील्ड-ऑफ-व्यू द्वारा एक लाइन हिस्टोग्राम टूल का उपयोग करके, जो सेट डिस्टेंस समूहों में फोटोस्विचिंग घटनाओं को पिन करता है। एकल ईवीएस की छवियां लें और उन्हें टिफ फ़ाइलों के रूप में सहेजें। जेड-एक्सिस के साथ प्लेसमेंट के अनुसार 3डी विज़ुअलाइज़ेशन टूल और रंग का उपयोग करके व्यक्तिगत ईवीएस के 3डी वीडियो बनाएं।माइक्रोस्कोप के अंशांकन के बाद जिसने जेड-एक्सिस पर एक्स, वाई-एक्सिस और 38 नैनोमीटर पर 16 नैनोमीटर की औसत त्रुटि का उत्पादन किया, शुद्ध u20s EVs को सफलतापूर्वक एक्स, वाई-एक्सिस और जेड-एक्सिस के साथ 20 नैनोमीटर तक के संकल्प के साथ कल्पना की गई थी। लेजर पावर बढ़ने के साथ-साथ 10, 000 फ्रेम एक्सपोजर में 3डी फोटोस्विच में dSTORM के माध्यम से कल्पना की गई व्यक्तिगत ईवीएस, और अधिग्रहीत छवि में आसानी से स्पष्ट थे। जेड-प्लेन में अधिग्रहण के बाद की छवि सुधार, फोटॉन मायने रखता है, सिग्मास, और खंगाला छवि के स्थानीयकरण परिशुद्धता 3 डी में EV का एक स्पष्ट समाधान के परिणामस्वरूप ।EV केवल पहले 7, 000 फ्रेम के दौरान फोटोस्विच, के रूप में ऊपरी दाहिने कोने में किंवदंती द्वारा देखा । हिस्टोग्राम इस बात की पुष्टि करता है कि अधिकांश फोटोस्विचिंग घटनाएं 100-नैनोमीटर त्रिज्या के भीतर हुईं, यह मान्य करती हैं कि कल्पना की गई EV एक एक्सोसोम है, और एक छोटे व्यास के ईवी का अलगाव सफल रहा। लाइन हिस्टोग्राम टूल और एक्स, वाई, जेड-प्लेन व्यू टूल का उपयोग करके अन्य व्यक्तिगत रूप से पता लगाए गए ईवीएस पर किए गए आकार वितरण विश्लेषण ने पुष्टि की कि अधिकांश फोटोस्विचिंग घटनाएं केंद्र के 100-नैनोमीटर त्रिज्या के भीतर हुईं।जेड-एक्सिस के साथ त्रुटि में वृद्धि हुई थी, जो अक्षीय धुरी के साथ ईवी की एक लम्बी अंतिम छवि का उत्पादन कर रही थी। फोटोस्विचिंग घटनाओं को ईवी आकार के साथ सहसंबद्ध नहीं किया गया था, यह प्रदर्शित करते हुए कि डीस्टॉर्म-आधारित लक्षण वर्णन का उपयोग छोटे ईवीएस जैसे एक्सोसोम्स और व्यास में 100 नैनोमीटर से कम छोटे वायरस के लिए किया जा सकता है। dSTORM प्रदर्शन करते समय प्रारंभिक लेजर शक्ति को बहुत कम सेट करना याद रखना महत्वपूर्ण है, और फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए धीरे-धीरे इसे पूरे छवि अधिग्रहण में बढ़ाता है।इसके विकास के बाद से, dSTORM ने शोधकर्ताओं को उप-सेलुलर संरचनाओं की आकृति विज्ञान को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति दी है जो पहले विशिष्ट प्रकाश माइक्रोस्कोपी की विवर्तन सीमा के कारण कल्पना करना असंभव है।

Research

JoVE Journal

Biology

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चरण कंट्रास्ट और अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (डीआईसी)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

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कोशिका-वातानुकूलित मीडिया से Extracellular बुलबुले के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

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Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल सेल जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर का पुनर्निर्माण

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