Name: direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Vi vil takke Oxford Nanoimaging for deres konstruktive tilbakemeldinger og veiledning. Dette arbeidet ble finansiert av 5UM1CA121947-10 til R.P.M. og 1R01DA040394 til D.P.D.

1 Overføring og vedlikehold av cellelinjer
<ol><li>Skaff deg humane osteosarkomceller (U2OS) og plasser cellene i vekstmediet supplert med 10% exosome-fri Fetal Bovine Serum og 1x Penicillin / Streptomycin løsning. MERK: Exosome-free Fetal Bovine Serum ble generert etter protokollen presentert i McNamara et. al.26.</li>
	<li>Vedlikehold U2OS-cellene i en kobberbelagt inkubator ved 37 °C i 5 % CO2 og passasjeceller i T175-kolber26,<sup class="xr...

Elbiler har blitt et populært studieområde på grunn av deres viktige rolle i mange intracellulære prosesser og celle-til-celle-signalering1,30. Imidlertid viser visualiseringen seg å være vanskelig ettersom deres lille størrelse faller under diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi. Direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM) er en direkte visualiseringsmetode som omgår diffraksjonsgrensen ved å fange fotobryterhendelser av individuelle flu...

Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er membranbundne vesikler utgitt av alle celletyper. De inneholder lipider, proteiner, metabolitter og nukleinsyrer og overfører disse materialene lokalt mellom celler og distalt mellom vev og organer. Det finnes tre primære undertyper av elbiler: apoptotiske legemer, mikrovesikler og eksosomer1,2. Her fokuserer vi vår diskusjon på eksosomer og deres tilknyttede proteiner.
Eksosomer utskilles vesicles som stammer fra innadvendt spirende tidlige endosomer inn i multivesicular kroppen (MVB). MVB smelter deretter sammen med plasmamembranen, og frigjør eksosomene i det ekstracellulære rommet for å reise til andre celler3,4. Eksosomer finnes på et spekter av størrelser fra 40 til 150 nm og er beriket med endosomale transmembraneproteiner kjent som tetraspaniner (CD9, CD63, CD81), membranbundet endosomal sorteringskompleks som kreves for transport (ESCRT) og lipidflåterelaterte proteiner1,2,5,6,7.
Karakterisering av den biokjemiske sammensetningen av eksosomer har blitt et populært felt for forskere å bedre forstå deres funksjonelle natur. Det finnes mange metoder for visualisering og karakterisering av eksosomer, inkludert nanoskala strømningscytometri, nanopartikkelsporingsanalyse (NTA), skanning og overføringselektronmikroskopi (TEM), overflateplasmonresonans, resistiv pulssensor og tradisjonell lysmikroskopi, som hver inneholder egen fordeler og ulemper8,9. TEM og cryo-EM kan oppnå nanometerbasert oppløsning, men krever ofte dehydrerings- og frysebruddtrinn, og dermed krympe eller lyse elbiler10,11. NTA er avhengig av lysspredning, noe som gjør det mulig å karakterisere hundrevis av elbiler om gangen, men er en indirekte måling av partikkelstørrelse og kan ikke enkelt skille mellom elbiler, virus og proteinmengder12,13,14,15,16. Nanoskala strømningscytometri bruker lysspredning fra en eksitasjonsbane, som deretter kan oversettes til størrelsesmålinger, men er en fremvoksende teknologi, og det er liten konsensus om hvilken størrelse partikler er innenfor det lineære deteksjonsområdet for ulike instrumenter12,17,18.
Tradisjonell lysmikroskopi ved hjelp av fluorescerende proteiner eller fargestoffer har vært en av de mest brukte teknikkene for visualisering av subcellulære rom, proteinkomplekser og signalmaskiner i en celle. Selv om denne teknikken viser seg nyttig for å visualisere lokaliseringen av komplekser, forhindrer diffraksjonsgrensen for tradisjonell lysmikroskopi (rundt 250-400 nm) den klare oppløsningen av proteiner eller strukturer i det typiske størrelsesområdet til et eksosom (40-150 nm)12,19,20.
Superoppløselig mikroskopi, nemlig direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM), skiller seg fra konvensjonell lysmikroskopi ved å bruke de fotobryterbare egenskapene til spesifikke fluoroforer og oppdage disse blinkende hendelsene for å rekonstruere bilder ned til nanometerpresisjon21. Photoswitching-hendelser samles inn ved hjelp av et høyt bildefrekvensdeteksjonskamera i løpet av titusenvis av individuelle eksponeringer, og en punktspredningsfunksjon brukes til å kartlegge med høy tillit den nøyaktige plasseringen av den fotobryter fluoroforen19,20,22. Dette gjør at dSTORM kan omgå diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi. Flere grupper har rapportert bruk av superoppløsningsteknikker for visualisering og sporing av eksosomer og tilhørende proteiner22,23,24,25. Den endelige oppløsningen avhenger av fluoroforens biofysiske egenskaper, men varierer ofte fra +/-10-100 nm langs XY-aksen, noe som tillater enkeltmolekyloppløsning.
Evnen til å løse individuelle fluoroforer i denne skalaen på XY-aksen har revolusjonert mikroskopi. Det er imidlertid lite data om den tredimensjonale (3D) dSTORM av et eksosom. Derfor forsøkte vi å etablere en standard operasjonsprosedyre (SOP) for dSTORM-basert visualisering og karakterisering av rensede elbiler, inkludert eksosomer til nanometerpresisjon i 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 &#181;-Slide 8 well plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration apparatus</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0142-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Flux S</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0384-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10616D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-cubed buffer</td>
			<td>ONI</td>
			<td>&#160;BCA0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frac 30 Fraction collector</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine pH=2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap CaptoCore 700 Column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17548151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9820003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoimager</td>
			<td>Oxford Nanoimaging</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A797C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flasks</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspek microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris- HCl pH=7.5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn V</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions

Ekstracellulære vesicles (ELBILER) frigjøres av alle celletyper og spiller en viktig rolle i cellesignalering og homeostase. Visualiseringen av elbiler krever ofte indirekte metoder på grunn av deres lille diameter (40-250 nm), som er under diffraksjonsgrensen for typisk lysmikroskopi. Vi har utviklet en mikroskopibasert visualisering av elbiler med superoppløsning for å omgå diffraksjonsgrensen i både to og tre dimensjoner. Ved hjelp av denne tilnærmingen kan vi løse den tredimensjonale formen på elbiler til innenfor +/- 20 nm oppløsning på XY-aksen og +/- 50 nm oppløsning langs Z-aksen. Til slutt foreslår vi at mikroskopi med superoppløsning betraktes som en karakteriseringsmetode for elbiler, inkludert eksosomer, samt innkapslede virus.

Målet med denne studien var å evaluere effektiviteten av superoppløsningsmikroskopi ved visualisering av individuelle elbiler med nanometeroppløsning i tre dimensjoner (3D). For å analysere formen og størrelsen på individuelle elbiler, brukte vi fotoswitchable fargestoff og inkuberte ELBIL-ene med et fjernt rødt, membraninterkalerende fargestoff, og fjernet overflødig fargestoff gjennom kromatografi29. De affinitetsfangede anti-CD81 og rødfargede ELBILER ble deretter sett i superoppløsn...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (dSTORM) brukes til å omgå den typiske diffraksjonsgrensen for lysmikroskopi og for å se eksosomer på nanometerskalaen. Det kan brukes i både to og tre dimensjoner for å karakterisere eksosomer.

Direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi av ekstracellulære vesicles i tre dimensjoner

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Denne protokollen bruker superoppløselig mikroskopi, spesielt direkte stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi, også kjent som dSTORM, for å omgå diffraksjonsgrensen og for å visualisere elbiler med nanometerpresisjon i tre dimensjoner. En bemerkelsesverdig fordel med dSTORM er dens evne til å visualisere partikler direkte under diffraksjonsnivået av lys uten skadelige trinn som endrer EV-ens biokjemiske natur. Mange evolusjonært distinkte virus bruker EV-signalering, derfor kan dSTORM brukes til å karakterisere elbiler for sykdomsbiomarkører og progresjon, samt å visualisere individuelle viruspartikler, for eksempel SARS-CoV2. Begynn med å plassere affinitetsrensede, ekstracellulære vesicles, eller ELBILER, på glassbunn, mikroslide, åtte brønnplater i et totalt volum på 200 mikroliter, og la dem holde seg til overflaten over natten ved fire grader Celsius.Uten å fjerne den eksisterende løsningen fra åttebrønnsplaten, fest elbiler på platene ved å tilsette 200 mikroliter 4% paraformaldehyd i 1X PBS til DEN EV-inneholdende løsningen i hver brønn og la platene inkubere i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern forsiktig paraformaldehyd og overflødig løsning med en mikropipette for ikke å forstyrre ELBIL-ene. Vask EV med 1X PBS for å fjerne overflødig paraformaldehyd.Utfør vaskeprosedyren tre ganger. Fjern overflødig 1X PBS. Forbered 250 mikroliter dSTORM Bcubed bufferløsning per prøve ved å lage en løsning på fem millimolar protocatechuic dioxygenase fortynnet i bildebuffer i henhold til produsentens protokoll.Tilsett 250 mikroliter av den forberedte bufferen til hver brønn i henhold til produsentens protokoll, og inkuber platene i 20 minutter ved romtemperatur før avbildning for å samle oksidasjonsmolekyler. ELBIL-ene kan visualiseres umiddelbart eller lagres ved fire grader Celsius i en uke. For å forberede perlene som kreves for kalibrering av superoppløsningsmikroskopet, fortynn 100 nanometermikrosfærer til en konsentrasjon på 0,5% i molekylærbiologisk vann, og pipette 200 mikroliter i hver brønn av en glassbunn, mikroslide, åttebrønns plate.La perlene bosette seg i brønnene i en time ved romtemperatur. Uten å fjerne den eksisterende løsningen, tilsett 200 mikroliter 4% paraformaldehyd i PBS til hver brønn til kalibreringsperleløsningen, og la den inkubere i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern forsiktig paraformaldehyden med en mikropipette for ikke å forstyrre perlene, og vask perlene tre ganger med 1X PBS.Klargjør bufferen som beskrevet i manuskriptet. Fjern 1X PBS og tilsett 250 mikroliter av den klargjorte bufferen til hver brønn. La bufferen sitte i 20 minutter før visualisering.Bruk knappen Koble til mikroskopet for å koble til 3D-mikroskopet før du plasserer noe på scenen. Tilsett 100X olje til målet, og plasser midten av brønnen på toppen av målet. I Acquire-innstillingen slår du på 473- og 640-nanometer eksitasjonslasere og klikker på Vis.Uten å aktivere 3D-objektivet, kan du se perlene under foto metningsinnstillingen ved å klikke på Foton-tellinger i bildevisningsalternativene. Sett de første laserkraftene til 8,4 milliwatt for 473-nanometerlaseren og 11,6 milliwatt for 640-nanometerlaseren. Reduser fokuset på laseren til rundt minus 300 nanometer eller fokusplanet til kalibreringsperlene for å produsere en klar oppløsning av de enkelte perlene.Når Z-flyet er fokusert, justerer du lasereffektnivåene ytterligere for å ta høyde for variasjon i hvert synsfelt. Under Instrument-funksjonene fullfører du kalibrering av 3D-kartlegging og kanalkartlegging for å få feilene på X-, Y- og Z-aksen. Sett maksimalt antall synsfelt til 20, målnummeret for punkt til 4 000, maksimal avstand mellom kanaler til 5,0 piksler og ekskluderingsradiusen mellom kanaler til 10,0 piksler under kanaltilordningskalibrering.Sørg for at kalibreringen gir en punktdekning på mer enn 90 %, og at kartkvaliteten er god. Lagre de gitte kalibreringsdataene for fremtidige bildeanskaffelser. Tilsett 100X olje på målet, og plasser de forberedte ELBIL-ene på mikroskopet.Uten å aktivere 3D-objektivet, slå på 640-nanometerets eksitasjonslaser, og øk det først til mellom 1,2 og 12,5 milliwatt, avhengig av intensiteten av signalet i synsfelt for å begeistre den røde membranen, interkalerende, fargefargede elbiler. Under Visningsalternativer for bilde bytter du visningsmetoden fra fotometning til persentiler for å visualisere EVene bedre. Juster lasereffekten for å minimere støy samtidig som du maksimerer signalet og opprettholder alle andre parametere.Juster fokuset på Z-planet ved å klikke opp- eller nedikonet på Z-aksen. Sett eksponeringstiden til 20 millisekunder, rammeopptaket til 10 000 bilder og den første lasereffekten til mellom 1,2 og 12,5 milliwatt, avhengig av intensiteten til signalet og synsfeltet. Aktiver 3D-objektivet ved hjelp av ikonet, og start oppkjøpet ved å klikke på Hent-knappen.Gjennom hele bildeanskaffelsesprosessen øker du laserkraften med tre trinn på 10 hver 1000 bilder, eller nok til å opprettholde et høyt signal-til-støy-forhold. Z-flyet må ikke justeres under oppkjøpet. Når du har anskaffet bildet, bytter du til visningsvinduet Analyser.Utfør driftkorrigering på det ufiltrerte bildet, og aktiver deretter filtre. Juster antall fotoner, lokaliseringspresisjon, sigmaer og rammeindeks, som nevnt i manuskriptet. Legg over et X-, Y-, Z-plane-visningsverktøy langs X-aksen til individuelle ELBILER fra synsfeltet, og eksporter de enkelte CSV-filene med fotoswitching-hendelser.Bisect individuelle elbiler på X, Y-aksen i et X by Y-synsfelt ved hjelp av et Line Histogram-verktøy, som fester photoswitching-hendelser i angitte avstandsgrupper. Ta bilder av enkelt-ELBILER og lagre dem som tif-filer. Lag 3D-videoer av individuelle elbiler ved hjelp av et 3D-visualiseringsverktøy og farge i henhold til plassering langs Z-aksen.Etter kalibreringen av mikroskopet som produserte en gjennomsnittlig feil på 16 nanometer på X- og Y-aksen og 38 nanometer på Z-aksen, ble de rensede u20s-EVene vellykket visualisert med en oppløsning på opptil 20 nanometer på X-, Y-aksen og 50 nanometer langs Z-aksen. Individuelle elbiler visualisert gjennom dSTORM i 3D-bilder som ble forhekset gjennom hele 10.000-rammeeksponeringen etter hvert som lasereffekten ble økt, og var lett synlig i det oppkjøpte bildet. Bildekorrigering etter anskaffelse i Z-planet, fotontellinger, sigmaer og lokaliseringspresisjon for det rekonstruerte bildet resulterte i en klar oppløsning av EV i 3D.EV-bildene ble bare tatt i løpet av de første 7000 rammene, sett av legenden i øvre høyre hjørne. Histogrammet bekrefter at de fleste photoswitching-hendelser skjedde innenfor en radius på 100 nanometer, og bekreftet at den visualiserte EV er et eksosom, og at isolasjonen av elbiler med liten diameter var vellykket. Størrelsesfordelingsanalyse utført på andre individuelt sporede elbiler ved hjelp av Line Histogram-verktøyet og X, Y, Z-plane View-verktøyet bekreftet at de fleste photoswitching-hendelser skjedde innenfor en radius på 100 nanometer i midten.Feilen langs Z-aksen ble økt, noe som ga et langstrakt sluttbilde av EV langs aksialaksen. Photoswitching-hendelser var ikke korrelert med EV-størrelse, noe som viser at dSTORM-basert karakterisering kan brukes til små elbiler som eksosomer og små, innhyllede virus mindre enn 100 nanometer i diameter. Mens du utfører dSTORM, er det viktig å huske å sette den første laserstrømmen veldig lav, og sakte øke den gjennom bildeanskaffelse for å forhindre fotobleaching.Siden utviklingen har dSTORM gjort det mulig for forskere å bedre forstå morfologien til sub-cellulære strukturer som tidligere har vært umulig å visualisere på grunn av diffraksjonsgrensen for typisk lysmikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

dyrking av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensjoner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Hemi-strupe oppsett for å studere vokal Fold vibrasjoner i tre dimensjoner

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

3-dimensjonal modell av vaskulær arkitekturen av passiv KLARHET klarert musen eggstokkene

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Tenkelig intermediære filamenter og piskehale som henger med 2-dimensjonal direkte Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse av ekstracellulære blemmer fra celle-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensing og analyse av Caenorhabditis elegans Ekstracellulære vesikler

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Rekonstruksjon av enkeltcellede medfødte fluorescenssignaturer ved konfektmikroskopi

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikkelsporingsanalyse for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av ekstracellulære vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...