Name: direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Oxford Nanoimaging за их конструктивную обратную связь и руководство. Эта работа финансировалась 5UM1CA121947-10 для R.P.M. и 1R01DA040394 для D.P.D.

1 Распространение и обслуживание клеточных линий
<ol><li>Приобретите клетки остеосаркомы человека (U2OS) и поместите клетки в питательную среду, дополненную 10% экзосомной сывороткой крупного рогатого скота без экзосом и 1x раствором пенициллина / стрептомицина. ПРИМЕЧАНИЕ: Фетальная бычь?...

Электромобили стали популярной областью исследований из-за их важной роли во многих внутриклеточных процессах и межклеточной передаче сигналов1,30. Однако их визуализация оказывается сложной, поскольку их небольшой размер падает ниже дифракционного пр?...

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой мембранно-связанные везикулы, высвобождаемые всеми типами клеток. Они содержат липиды, белки, метаболиты и нуклеиновые кислоты и переносят эти материалы локально между клетками и дистально между тканями и органами. Существует три основных подтипа EV: апоптотические тела, микровезикулы и экзосомы1,2. Здесь мы сосредоточим наше обсуждение на экзосомах и связанных с ними белках.
Экзосомы представляют собой секретируемые везикулы, возникающие из внутреннего бутонизации ранних эндосом в мультивезикулярное тело (MVB). Затем MVB сливается с плазматической мембраной, высвобождая экзосомы во внеклеточное пространство для перемещения в другие клетки3,4. Экзосомы существуют в спектре размеров от 40 до 150 нм и обогащены эндосомальными трансмембранными белками, известными как тетраспанины (CD9, CD63, CD81), мембранно-связанным эндосомальным сортировочным комплексом, необходимым для транспорта (ESCRT), и липидными рафт-ассоциированными белками1,2,5,6,7.
Характеристика биохимического состава экзосом стала популярной областью для исследователей, чтобы лучше понять их функциональную природу. Существует множество методов визуализации и характеристики экзосом, включая наноразмерную проточную цитометрию, анализ отслеживания наночастиц (NTA), сканирующую и просвечивающую электронную микроскопию (TEM), поверхностный плазмонный резонанс, резистивное импульсное зондирование и традиционную световую микроскопию, каждая из которых содержит внутренние плюсы и минусы8,9. ТЭМ и крио-ЭМ могут достигать нанометрового разрешения, но часто требуют этапов обезвоживания и замораживания-разрушения, тем самым уменьшая или лизуя EV10,11. NTA полагается на рассеяние света, позволяя характеризовать сотни EV одновременно, но является косвенным измерением размера частиц и не может легко различить EV, вирусы и белковые агрегаты12,13,14,15,16. Наноразмерная проточная цитометрия использует рассеяние света от пути возбуждения, которое затем может быть преобразовано в измерения размера, но является новой технологией, и существует мало консенсуса относительно того, какой размер частиц находится в линейном диапазоне обнаружения для различных инструментов12,17,18.
Традиционная световая микроскопия с использованием флуоресцентных белков или красителей была одним из наиболее широко используемых методов визуализации субклеточных компартментов, белковых комплексов и сигнальных механизмов внутри клетки. Хотя этот метод оказывается полезным при визуализации локализации комплексов, дифракционный предел традиционной световой микроскопии (около 250-400 нм) препятствует четкому разрешению белков или структур в типичном диапазоне размеров экзосомы (40-150 нм)12,19,20.
Микроскопия сверхвысокого разрешения, а именно прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM), отличается от обычной световой микроскопии тем, что использует фотопереключаемые свойства конкретных флуорофоров и обнаруживает эти мигающие события для реконструкции изображений до нанометровой точности21. События переключения фотографий собираются с помощью камеры обнаружения с высокой частотой кадров в течение десятков тысяч индивидуальных экспозиций, а функция точечного распространения используется для отображения с высокой степенью достоверности точного местоположения фотопереключающего флуорофора19,20,22. Это позволяет dSTORM обходить дифракционный предел световой микроскопии. Несколько групп сообщили об использовании методов сверхвысокого разрешения для визуализации и отслеживания экзосом и связанных с ними белков22,23,24,25. Конечное разрешение зависит от биофизических свойств флуорофора, но часто колеблется от +/-10-100 нм вдоль оси XY, что позволяет использовать одномолекулярное разрешение.
Способность разрешать отдельные флуорофоры в этом масштабе на оси XY произвела революцию в микроскопии. Тем не менее, существует мало данных о трехмерном (3-D) dSTORM экзосомы. Поэтому мы стремились установить стандартную операционную процедуру (SOP) для визуализации и характеристики очищенных электромобилей на основе dSTORM, включая экзосомы с нанометровой точностью в 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 &#181;-Slide 8 well plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration apparatus</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0142-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Flux S</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0384-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10616D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-cubed buffer</td>
			<td>ONI</td>
			<td>&#160;BCA0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frac 30 Fraction collector</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine pH=2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap CaptoCore 700 Column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17548151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9820003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoimager</td>
			<td>Oxford Nanoimaging</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A797C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flasks</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspek microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris- HCl pH=7.5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn V</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions

Внеклеточные везикулы (EV) высвобождаются всеми типами клеток и играют важную роль в клеточной сигнализации и гомеостазе. Визуализация электромобилей часто требует косвенных методов из-за их малого диаметра (40-250 нм), который ниже дифракционного предела типичной световой микроскопии. Мы разработали визуализацию электромобилей на основе микроскопии сверхвысокого разрешения, чтобы обойти дифракционный предел как в двух, так и в трех измерениях. Используя этот подход, мы можем разрешить трехмерную форму электромобилей с разрешением +/- 20 нм по оси XY и разрешением +/- 50 нм по оси Z. В заключение мы предлагаем рассматривать микроскопию сверхвысокого разрешения как метод характеристики EV, включая экзосомы, а также вирусы в оболочке.

Целью этого исследования была оценка эффективности микроскопии сверхвысокого разрешения в визуализации отдельных электромобилей с нанометровым разрешением в трех измерениях (3-D). Чтобы проанализировать форму и размер отдельных электромобилей, мы использовали фотопереключаемый кра?...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (dSTORM) используется для обхода типичного дифракционного предела световой микроскопии и для просмотра экзосом в нанометровом масштабе. Он может быть использован как в двух, так и в трех измерениях для характеристики экзосом.

Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия внеклеточных везикул в трех измерениях

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Этот протокол использует микроскопию сверхвысокого разрешения, в частности прямую стохастическую оптическую реконструкционную микроскопию, также известную как dSTORM, для обхода дифракционного предела и визуализации электромобилей с нанометровой точностью в трех измерениях. Одним из заметных преимуществ dSTORM является его способность непосредственно визуализировать частицы ниже уровня дифракции света без повреждения шагов, которые изменяют биохимическую природу EV. Многие эволюционно различные вирусы используют сигнализацию EV, поэтому dSTORM может быть использован для характеристики EV для биомаркеров и прогрессирования заболевания, а также для визуализации отдельных вирусных частиц, таких как SARS-CoV2. Начните с размещения аффинно-очищенных внеклеточных везикул или EV на стеклянные, микроскользящие, восьмилуночные пластины общим объемом 200 микролитров и позвольте им прилипнуть к поверхности в течение ночи при четырех градусах Цельсия.Не удаляя существующий раствор из восьмилуночной пластины, закрепите EV на пластинах, добавив 200 микролитров 4%-го параформальдегида в 1X PBS к EV-содержащему раствору в каждой скважине и дайте пластинам инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Осторожно удалите параформальдегид и избыток раствора с помощью микропипетки, чтобы не нарушить работу электромобилей. Вымойте EV с 1X PBS, чтобы удалить избыток параформальдегида.Выполните процедуру умывания три раза. Удалите лишние 1X PBS. Готовят 250 микролитров буферного раствора dSTORM Bcubed на образец путем создания раствора пятимиллимолярной протокатехуической диоксигеназы, разбавленной в буфере визуализации в соответствии с протоколом производителя.Добавьте 250 микролитров подготовленного буфера к каждой скважине в соответствии с протоколом производителя и инкубируйте пластины в течение 20 минут при комнатной температуре перед визуализацией для очистки окисляющих молекул. Электромобили могут быть визуализированы сразу или храниться при четырех градусах Цельсия в течение недели. Для подготовки шариков, необходимых для калибровки микроскопа сверхвысокого разрешения, разбавляют 100-нанометровые микросферы до концентрации 0,5% в воде класса молекулярной биологии и пипетку по 200 микролитров в каждую скважину стеклянного дна, микроскольжения, восьмилуночной пластины.Дайте шарикам осесть в колодцах в течение одного часа при комнатной температуре. Не удаляя имеющийся раствор, добавляют 200 микролитров 4%-ного параформальдегида в ПБС в каждую лунку к калибровочному шариковому раствору, и дают инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. Осторожно удалите параформальдегид микропипеткой, чтобы не потревожить бусины, и трижды вымойте бусины 1X PBS.Подготовьте буфер, как описано в рукописи. Удалите 1X PBS и добавьте 250 микролитров подготовленного буфера в каждую лунку. Дайте буферу посидеть в течение 20 минут перед визуализацией.Используйте кнопку Подключить микроскоп для подключения к 3D-микроскопу перед размещением чего-либо на сцене. Добавьте 100X масла к цели и поместите центр скважины поверх цели. В настройке «Получить» включите 473- и 640-нанометровые лазеры возбуждения и нажмите «Вид».Не активируя 3D-объектив, просмотрите бусины под настройкой насыщенности фотонов, щелкнув Счетчики фотонов в параметрах отображения изображения. Установите начальную мощность лазера на 8,4 милливатта для 473-нанометрового лазера и 11,6 милливатт для 640-нанометрового лазера. Уменьшите фокус лазера примерно до минус 300 нанометров или фокальной плоскости калибровочных шариков, чтобы получить четкое разрешение отдельных шариков.После того, как Z-плоскость сфокусирована, дополнительно отрегулируйте уровни мощности лазера, чтобы учесть изменения в каждом поле зрения. В соответствии с функциями прибора выполните калибровку 3D-отображения и калибровку отображения каналов для получения ошибок на оси X, Y и Z. установите максимальное число полей зрения равным 20, целевое число точек — 4 000, максимальное расстояние между каналами — 5,0 пикселя, а радиус исключения между каналами — 10,0 пикселя во время калибровки сопоставления каналов.Убедитесь, что калибровка обеспечивает охват точек более 90% и хорошее качество отображения. Сохраните данные калибровки для будущих сборов изображений. Добавьте 100X масла на объектив и поместите подготовленные электромобили на микроскоп.Не активируя 3D-линзу, включите 640-нанометровый лазер возбуждения и первоначально поднимите его до 1,2-12,5 милливатт, в зависимости от интенсивности сигнала в поле зрения, чтобы возбудить красную мембрану, интеркалирующие, окрашенные красителем ev. В разделе Параметры отображения изображения переключите метод просмотра с насыщенности фотонов на процентили, чтобы лучше визуализировать электромобили. Отрегулируйте мощность лазера, чтобы свести к минимуму шум, максимизируя сигнал и сохраняя все остальные параметры.Отрегулируйте фокус плоскости Z, щелкнув значок вверх или вниз по оси Z. Установите время экспозиции на 20 миллисекунд, захват кадра на 10 000 кадров и начальную мощность лазера на расстоянии от 1,2 до 12,5 милливатт в зависимости от интенсивности сигнала и поля зрения. Активируйте 3D-объектив с помощью значка и начните съемку, нажав на кнопку «Получить».На протяжении всего процесса получения изображения повышайте мощность лазера на три шага по 10 каждые 1000 кадров или достаточно для поддержания высокого отношения сигнал/шум. Не регулируйте Z-плоскость во время захвата. После получения изображения переключитесь в окно просмотра Анализ.Выполните коррекцию дрейфа на нефильтрованном изображении, а затем активируйте фильтры. Отрегулируйте количество фотонов, точность локализации, сигмы и индекс кадра, как указано в рукописи. Наложите инструмент просмотра плоскости X, Y, Z вдоль оси X отдельных электромобилей из поля зрения и экспортируйте отдельные CSV-файлы событий переключения фотографий.Разделите пополам отдельные электромобили по оси X, Y в поле зрения X by Y с помощью инструмента «Гистограмма линии», который закрепляет события переключения фотографий в заданные группы расстояний. Делайте снимки отдельных электромобилей и сохраняйте их в виде файлов tif. Создавайте 3D-видео отдельных электромобилей с помощью инструмента 3D-визуализации и раскрашивайте их в соответствии с размещением вдоль оси Z.После калибровки микроскопа, которая дала среднюю погрешность 16 нанометров на оси X, Y и 38 нанометров на оси Z, очищенные электромобили u20s были успешно визуализированы с разрешением до 20 нанометров по оси X, Y и 50 нанометров вдоль оси Z. Отдельные электромобили, визуализированные через dSTORM в 3D-фотографиях, переключались на протяжении 10 000 кадров по мере увеличения мощности лазера и были легко видны на полученном изображении. Коррекция изображения после получения в Z-плоскости, количество фотонов, сигмы и точность локализации реконструированного изображения привели к четкому разрешению EV в 3D.Фотографии EV переключались только в течение первых 7000 кадров, как видно легенде в правом верхнем углу. Гистограмма подтверждает, что большинство событий фотопереключения произошло в радиусе 100 нанометров, подтверждая, что визуализированный EV является экзосомой, и что изоляция электромобилей небольшого диаметра была успешной. Анализ распределения размеров, выполненный на других индивидуально прослеженных электромобилях с использованием инструмента «Гистограмма линии» и инструмента «X, Y, Z-plane View», подтвердил, что большинство событий фотопереключения произошло в радиусе 100 нанометров от центра.Погрешность вдоль оси Z была увеличена, что привело к удлиненному конечному изображению EV вдоль осевой оси. События переключения фотографий не коррелировали с размером EV, демонстрируя, что характеристика на основе dSTORM может использоваться для небольших электромобилей, таких как экзосомы и небольшие вирусы с оболочкой диаметром менее 100 нанометров. При выполнении dSTORM важно не забывать устанавливать начальную мощность лазера очень низко и медленно повышать ее на протяжении всего захвата изображения, чтобы предотвратить фотоотбеливание.С момента своего развития dSTORM позволил исследователям лучше понять морфологию субклеточных структур, которые ранее было невозможно визуализировать из-за дифракционного предела типичной световой микроскопии.

Research

JoVE Journal

Biology

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Фазового контраста и дифференциальных помех контраста (DIC) микроскопии

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Выращивание<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; В трех измерениях в лаборатории

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Hemi гортани установки для изучения вибрации голосовых связок в трех измерениях

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Трехмерная реконструкция сосудистой архитектуры пассивной очистили ЯСНОСТИ мыши яичника

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging промежуточных филаментов и микротрубочек с 2-мерной прямой стохастических оптических реконструкции микроскопия

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Гранулярных анализ внеклеточного Vesicles из клеток кондиционером СМИ потока

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Реконструкция одноклеточных врожденных флуоресцентных сигнатур с помощью конфокальной микроскопии

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Анализ отслеживания наночастиц для количественной оценки и определения размера внеклеточных везикул

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...