Name: direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Vi vill tacka Oxford Nanoimaging för deras konstruktiva feedback och vägledning. Detta arbete finansierades av 5UM1CA121947-10 till R.P.M. och 1R01DA040394 till D.P.D.

1 Spridning och underhåll av cellinjer
<ol><li>Förvärva humana osteosarkomceller (U2OS) och placera cellerna i tillväxtmediet kompletterat med 10% exosomfritt fetalt bovinserum och 1x Penicillin/Streptomycin lösning. OBS: Exosomfria fetala nötkreatur serum genererades efter protokollet presenteras i McNamara et. al.26.</li>
	<li>Håll U2OS-cellerna i en kopparbelagd inkubator vid 37 °C i 5% CO2 och passageceller i T175-flaskorna26,<sup clas...

EVs har blivit ett populärt studieområde på grund av deras viktiga roll i många intracellulära processer och cell-till-cell-signalering1,30. Deras visualisering visar sig dock vara svår eftersom deras lilla storlek faller under diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi. Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) är en direkt visualiseringsmetod som kringgår diffraktionsgränsen genom att fånga fotowitching händelser av enskilda fluorofor...

Extracellulära blåsor (EVs) är membranbundna blåsor som frigörs av alla celltyper. De innehåller lipider, proteiner, metaboliter och nukleinsyror och överför dessa material lokalt mellan celler och distally mellan vävnader och organ. Det finns tre primära undertyper av EVs: apoptotiska kroppar, mikrovesicles och exosomer1,2. Här fokuserar vi vår diskussion på exosomer och deras tillhörande proteiner.
Exosomer är utsöndrade blåsor som härrör från inåtgående spirande av tidiga endosomer i den multivesikulära kroppen (MVB). MVB smälter sedan samman med plasmamembranet och släpper ut exosomerna i det extracellulära utrymmet för att resa till andra celler3,4. Exosomer finns på ett spektrum av storlekar från 40 till 150 nm och är berikade med endosomala transmembranproteiner som kallas tetraspaniner (CD9, CD63, CD81), membranbunden endosomal sorteringskomplex som krävs för transporten (ESCRT) och lipidflotteassocierade proteiner1,2,5,6,7.
Att karakterisera exosomernas biokemiska sammansättning har blivit ett populärt område för forskare att bättre förstå deras funktionella natur. Många metoder finns för att visualisera och karakterisera exosomer, inklusive nanoskala flöde cytometri, nanopartikelspårningsanalys (NTA), skannings- och transmissionselektronmikroskopi (TEM), ytplasmonresonans, resistiv pulsavkänning och traditionell ljusmikroskopi, som var och en innehåller inneboende fördelar och nackdelar8,9. TEM och cryo-EM kan uppnå nanometerbaserad upplösning, men kräver ofta uttorkning och frysfraktursteg och därmed krymper eller lysar EVs10,11. NTA förlitar sig på ljusspridning, vilket möjliggör karakterisering av hundratals EVs åt gången, men är en indirekt mätning av partikelstorlek och kan inte enkelt skilja mellan EVs, virus och proteinaggregat12,13,14,15,16. Nanoskala flöde cytometri använder ljusspridning från en excitationsväg, som sedan kan översättas till storleksmätningar, men är en framväxande teknik, och det finns lite konsensus om vilken storlek på partiklar som ligger inom det linjära detektionsområdet för olika instrument12,17,18.
Traditionell ljusmikroskopi med fluorescerande proteiner eller färgämnen har varit en av de mest använda teknikerna för att visualisera subcellulära fack, proteinkomplex och signalmaskiner i en cell. Medan denna teknik visar sig användbar för att visualisera lokalisering av komplex, förhindrar diffraktionsgränsen för traditionell ljusmikroskopi (cirka 250-400 nm) den tydliga upplösningen av proteiner eller strukturer i det typiska storleksområdet för en exosom (40-150 nm)12,19,20.
Superupplösningsmikroskopi, nämligen direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM), skiljer sig från konventionell ljusmikroskopi genom att använda de fotowitchable egenskaperna hos specifika fluoroforer och upptäcka dessa blinkande händelser för att rekonstruera bilder ner till nanometerprecision21. Fotowitching händelser samlas in med hjälp av en hög-framerate detekteringskamera under loppet av tiotusentals individuella exponeringar, och en punktspridningsfunktion används för att med hög säkerhet kartlägga den exakta platsen för den fotowitching fluorophore19,20,22. Detta gör det möjligt för dSTORM att kringgå diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi. Flera grupper har rapporterat användningen av superupplösningstekniker för att visualisera och spåra exosomer och deras associerade proteiner22,23,24,25. Den slutliga upplösningen beror på fluoroforens biofysiska egenskaper, men sträcker sig ofta från +/-10-100 nm längs XY-axeln, vilket möjliggör enmolekylsupplösning.
Förmågan att lösa enskilda fluoroforer i denna skala på XY-axeln har revolutionerat mikroskopi. Det finns dock lite data om den tredimensionella (3D) dSTORM av en exosom. Därför försökte vi upprätta ett standardförfarande (SOP) för dSTORM-baserad visualisering och karakterisering av renade EVs, inklusive exosomer till nanometerprecision i 3D.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 &#181;-Slide 8 well plates</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Penicillin Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL 0.22 &#181;m vacuum filtration apparatus</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0142-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Flux S</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0384-37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD81 magnetic beads</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10616D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-cubed buffer</td>
			<td>ONI</td>
			<td>&#160;BCA0017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellMask Red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C10046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dubelco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frac 30 Fraction collector</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine pH=2.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap CaptoCore 700 Column</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17548151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Biology Grade Water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>9820003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoimager</td>
			<td>Oxford Nanoimaging</td>
			<td>Custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehhyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP233-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A797C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T175 Flasks</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetraspek microspheres</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris- HCl pH=7.5</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unicorn V</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29022094-ECOMINSSW</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct stochastic optical reconstruction microscopy of extracellular vesicles in three dimensions

Extracellulära blåsor (EVs) frigörs av alla celltyper och spelar en viktig roll i cellsignalering och homeostas. Visualiseringen av EVs kräver ofta indirekta metoder på grund av deras lilla diameter (40-250 nm), vilket ligger under diffraktionsgränsen för typisk ljusmikroskopi. Vi har utvecklat en mikroskopibaserad visualisering av EL-apparater med superupplösning för att kringgå diffraktionsgränsen i både två och tre dimensioner. Med den här metoden kan vi lösa den tredimensionella formen av EVs till inom +/- 20 nm upplösning på XY-axeln och +/- 50 nm upplösning längs Z-axeln. Sammanfattningsvis föreslår vi att superupplösningsmikroskopi betraktas som en karakteriseringsmetod för EVs, inklusive exosomer, samt höljevirus.

Målet med denna studie var att utvärdera effektiviteten av superupplösningsmikroskopi vid visualisering av enskilda EVs med nanometerupplösning i tre dimensioner (3-D). För att analysera formen och storleken på enskilda EVs använde vi fotowitchable färgämne och inkuberade EVs med ett långt rött, membran intercalating färgämne och tog bort överflödigt färgämne genom kromatografi29. Affinitet-fångade anti-CD81 och röd-färgade EVs visades sedan i superupplösning mikroskop under 6...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions at JoVE.com

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM) används för att kringgå den typiska diffraktionsgränsen för ljusmikroskopi och för att visa exosomer på nanometerskalan. Det kan användas i både två och tre dimensioner för att karakterisera exosomer.

Direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi av extracellulära blåsor i tre dimensioner

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Detta protokoll använder superupplösningsmikroskopi, särskilt direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi, även känd som dSTORM, för att kringgå diffraktionsgränsen och visualisera EVs med nanometerprecision i tre dimensioner. En anmärkningsvärd fördel med dSTORM är dess förmåga att direkt visualisera partiklar under ljusets diffraktionsnivå utan att skada steg som förändrar EV: s biokemiska natur. Många evolutionärt distinkta virus använder EV-signalering, därför kan dSTORM användas för att karakterisera EVs för sjukdomsbiomarkörer och progression, samt för att visualisera enskilda viruspartiklar, såsom SARS-CoV2. Börja med att placera affinitetsrenade, extracellulära blåsor eller EVs på glasbotten, mikroslide, åtta brunnsplattor i en total volym av 200 mikroliter och låt dem hålla fast vid ytan över natten vid fyra grader Celsius.Utan att ta bort den befintliga lösningen från åtta-brunnsplattan, fixera EVs på plattorna genom att tillsätta 200 mikroliter av 4% paraformaldehyd i 1X PBS till EV-innehållande lösning i varje brunn och låt plattorna inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort paraformaldehyd och överflödig lösning med en mikropipette för att inte störa EL-fordonen. Tvätta EV med 1X PBS för att avlägsna överskott av paraformaldehyd.Utför tvättproceduren tre gånger. Ta bort överflödig 1X PBS. Förbered 250 mikroliter dSTORM Bcubed buffertlösning per prov genom att skapa en lösning av fem millimolar protocatechuic dioxygenas utspädd i bildbuffert enligt tillverkarens protokoll.Tillsätt 250 mikroliter av den beredda bufferten till varje brunn enligt tillverkarens protokoll och inkubera plattorna i 20 minuter vid rumstemperatur innan avbildning för att rensa oxiderande molekyler. EVs kan visualiseras omedelbart eller lagras vid fyra grader Celsius i en vecka. För att förbereda de pärlor som krävs för kalibrering av superupplösningsmikroskopet, späd 100-nanometers mikrosfärer till en koncentration av 0,5% i molekylärbiologiskt vatten och pipetten 200 mikroliter i varje brunn på en glasbotten, mikroslide, åtta brunnsplatta.Låt pärlorna bosätta sig i brunnarna i en timme vid rumstemperatur. Utan att ta bort den befintliga lösningen, tillsätt 200 mikroliter av 4% paraformaldehyd i PBS till varje brunn till kalibreringspärlalösningen och låt inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Ta försiktigt bort paraformaldehyden med en mikropipette för att inte störa pärlorna och tvätta pärlorna tre gånger med 1X PBS.Förbered bufferten enligt beskrivningen i manuskriptet. Ta bort 1X PBS och tillsätt 250 mikroliter av den beredda bufferten till varje brunn. Låt bufferten sitta i 20 minuter före visualisering.Använd knappen Anslut mikroskopet för att ansluta till 3D-mikroskopet innan du placerar något på scenen. Tillsätt 100X olja till målet och placera mitten av brunnen ovanpå målet. Slå på 473- och 640-nanometers excitationslasrarna i inställningen Förvärva och klicka på Visa.Utan att aktivera 3D-objektivet kan du visa pärlorna under inställningen fotonmättnad genom att klicka på Antal foton i bildvisningsalternativen. Ställ in de ursprungliga laserkrafterna på 8,4 milliwatt för lasern på 473 nanometer och 11,6 milliwatt för lasern på 640 nanometer. Minska laserns fokus till cirka minus 300 nanometer eller kalibreringspärornas brännplan för att ge en tydlig upplösning av de enskilda pärlorna.När Z-planet är fokuserat justerar du lasereffektnivåerna ytterligare för att ta hänsyn till variationen i varje synfält. Under instrumentfunktionerna slutför du kalibrering av 3D-mappning och kanalmappning för att få felen på X-, Y- och Z-axeln. ange det maximala antalet synfält till 20, målantalet punkter till 4 000, det maximala avståndet mellan kanalerna till 5,0 bildpunkter och uteslutningsradien mellan kanalerna till 10,0 pixlar under kalibrering av kanalmappning.Se till att kalibreringen ger en punkttäckning på mer än 90 % och kartkvalitet som är bra. Spara givna kalibreringsdata för framtida bildförvärv. Tillsätt 100X olja på målet och placera de förberedda EL:erna på mikroskopet.Utan att aktivera 3D-objektivet slår du på 640-nanometers excitationslasern och höjer den inledningsvis till mellan 1,2 och 12,5 milliwatt, beroende på signalens intensitet i synfältet för att excitera det röda membranet, intercalating, färgfärgade EVs. Under Alternativen för bildvisning växlar du visningsmetoden från fotonmättnad till percentiler för att bättre visualisera EVs. Justera lasereffekten för att minimera bruset samtidigt som signalen maximeras och alla andra parametrar bibehålls.Justera Z-planets fokus genom att klicka på upp- eller nedikonen på Z-axeln. Ställ in exponeringstiden på 20 millisekunder, bildrutan fångas upp på 10 000 bildrutor och den ursprungliga lasereffekten till mellan 1,2 och 12,5 milliwatt, beroende på signalens intensitet och synfält. Aktivera 3D-objektivet med ikonen och starta förvärvet genom att klicka på knappen Hämta.Under hela bildförvärvsprocessen höjer du lasereffekten med tre steg om 10 var 1 000:e bildrutor, eller tillräckligt för att upprätthålla ett högt signal-till-brus-förhållande. Justera inte Z-planet under förvärvet. Efter bildförvärvet växlar du över till visningsfönstret Analysera.Utför driftkorrigering på den ofiltrerade bilden och aktivera sedan filter. Justera fotonantal, lokaliseringsprecision, sigmas och ramindex, som nämns i manuskriptet. Lägg över ett X-, Y-planvyverktyg längs X-axeln för enskilda EVs från synfältet och exportera de enskilda csv-filerna med fotowitching-händelser.Dela enskilda EVs på X, Y-axeln i ett X x Y-synfält med hjälp av ett linje histogramverktyg, som fäster fotosamtalshändelser i inställda avståndsgrupper. Ta bilder av enskilda EVs och spara dem som tif-filer. Skapa 3D-videor av enskilda EVs med ett 3D-visualiseringsverktyg och färg enligt placering längs Z-axeln.Efter kalibreringen av mikroskopet som gav ett genomsnittligt fel på 16 nanometer på X-, Y-axeln och 38 nanometer på Z-axeln visualiserades de rena u20-tals-EVs framgångsrikt med en upplösning på upp till 20 nanometer på X-, Y-axeln och 50 nanometer längs Z-axeln. Enskilda EVs visualiseras genom dSTORM i 3D-bilderwitched under hela 10,000 bildrutan exponering som laser kraften ökade, och var lätt uppenbara i den förvärvade bilden. Efter förvärvet av bildkorrigering i Z-planet, fotonräkningar, sigmas och lokaliseringsprecision av den rekonstruerade bilden resulterade i en tydlig upplösning av EV i 3D.EV-bilderna var bara under de första 7 000 bildrutorna, vilket legenden såg i det övre högra hörnet. Histogrammet bekräftar att majoriteten av fotowitching händelser inträffade inom en 100-nanometer radie, validerar att den visualiserade EV är en exosome, och att isoleringen av EVs med liten diameter lyckades. Storleksfördelningsanalys utförd på andra individuellt spårade EVs med hjälp av Linje Histogram-verktyget och X, Y, Z-plan View-verktyget bekräftade att de flesta fotowitching händelser inträffade inom en radie av 100 nanometer från mitten.Felet längs Z-axeln ökades, vilket ger en långsträckt slutlig bild av EV längs axialaxeln. Fotowitching händelser var inte korrelerade med EV storlek, visar att dSTORM-baserade karakterisering kan användas för små EVs som exosomer och små, omslutna virus mindre än 100 nanometer i diameter. När du utför dSTORM är det viktigt att komma ihåg att ställa in den ursprungliga lasereffekten mycket låg och långsamt höja den under hela bildförvärvet för att förhindra fotobleaching.Sedan dess utveckling har dSTORM gjort det möjligt för forskare att bättre förstå morfologin hos subcellulära strukturer som tidigare har varit omöjliga att visualisera på grund av diffraktionsgränsen för typisk ljusmikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biology

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

Faskontrast och differentierad interferenskontrast (DIC) Mikroskopi

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

odling av<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; I tre dimensioner i laboratoriet

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

Hemi-laryngeal Setup for Studying Vocal Fold Vibration in Three Dimensions

Hemi-larynx Setup för att studera stämbandens vibrationer i tre dimensioner

The voice of humans and most non-human mammals is generated in the larynx through self-sustaining oscillation of the vocal folds. Direct visual ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

Tredimensionell rekonstruktion av vaskulär arkitekturen av passiv tydlighet-godkänt mus äggstocken

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

Imaging intermediär filament och mikrotubuli med 2-dimensionell direkt stokastiska optiska återuppbyggnad mikroskopi

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Rekonstruktion av encelliga medfödda fluorescenssignaturer av konfokal mikroskopi

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikelspårningsanalys för kvantifiering och storleksbestämning av extracellulära blåsor

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...