Denne metode var designet til at kvantificere kontaktafhængig konkurrence via type VI sekretionssystem mellem bakteriestammer på enkeltcelleniveau. Denne teknik bruger det samlede celleområde i stedet for celletal til at kvantificere bakteriekonkurrencer, hvilket gør det nemt for forskere uden proprietær billedanalysesoftwareadgang. Denne metode kan let ændres for at kvantificere konkurrencen mellem forskellige dyrkelige mikrober.
Derudover kan den eksperimentelle opsætning optimeres til brug på enten opretstående eller omvendte mikroskoper. Til at begynde med forberede agarose pad opløsning ved at opløse 2% lav smelte agarose i marine PBS. Varm opløsningen kortvarigt i ca. 30 sekunder i mikrobølgeovnen og hvirvlen, indtil agarose er helt opløst.
Hold denne løsning i en 55 grader Celsius vandbad indtil klar til brug. Derefter ombrydes et stykke laboratoriebånd omkring en glasrutschebane fem gange. Gentag indpakning af tape på samme dias, således at afstanden mellem de to båndstykker er lidt mindre end coverslipbredden.
For at sikre en flad agarose pad overflade, pipette varm agarose opløsning mellem de to stykker tape og straks sætte en coverlip på toppen, således at coverlip gør kontakt med væsken og skubber eventuelle bobler i agarose opløsning. Lad agarosepuden størkne ved stuetemperatur i mindst en time. Skær derefter denne agarose pad med et barberblad i fire 5 kvadrat millimeter puder, der skal bruges til billeddannelse.
For at forberede stammerne til co-inkubation, streak ud hver stamme fra frosne lagre på LBS agar plader suppleret med passende antibiotika og inkubere natten over ved 24 grader Celsius. Den næste dag, vælge to kolonier fra hver stamme og genbruge kolonierne i antibiotika suppleret LBS medium. Inkuber re suspenderet kolonier natten over ved 24 grader Celsius med ryste på 200 rotationer i minuttet.
Den næste morgen, subkultur hver biologisk replikere en i 1.000 gange frisk LBS medium uden antibiotika og inkubere indtil cellerne nå en optisk densitet på omkring 1,5 på 600 nanometer. Mål og registrer den optiske tæthed ved 600 nanometer for alle prøver. Normaliser hver prøve til en optisk densitet på én ved at fortynde kulturen med LBS medium.
Bland de to konkurrerende stammer i et lige forhold ved at tilføje 30 mikroliter af hver normaliseret stamme til et mærket 1,5 milliliterrør. Vortex den blandede stamme kultur i et til to sekunder. Bland de konkurrerende stammer for hver biologisk replikation og behandling for at generere i alt fire blandede stammerør.
Koncentrer hver blandet kultur tre gange ved at centrifugere for at sikre tilstrækkeligt tætte konkurrerende celler til kontaktafhængig aflivning under inkubation. Kassér supernatanten, genbrug hver pille i 20 mikroliter lbs-medium, og udfør koncentrationsprocedurer for hver prøve. Hvis billeddannelse på en omvendt mikroskop, begynde med at spotte to mikroliter af en blandet kultur på antallet 1,5 coverlip bunden af en 35 millimeter Petri parabol og placere agarose pad over co-inkubation stedet.
Placer en 12 millimeter cirkulær glas coverlip over agarose pad. Gentag spotting og placering af coverslip for de resterende tre blandede kulturer, hvilket vil resultere i fire retter, der skal afbildes. Før du fortsætter fremad, lad diasene sidde på bænktoppen i ca. fem minutter, så cellerne kan slå sig ned på agarpuden for at undgå bevægelse under billeddannelsesprocessen.
Begynd med at fokusere på celler, der bruger DIC for at minimere fotobleaching effekter. Baseret på den gennemsnitlige størrelse af en enkelt bakteriecelle, skal du bruge et 100X oliemål. Juster eksponeringstiden og anskaffelsesindstillingerne for hver kanal med minimal baggrundsregistrering.
Vælg mindst fem visningsfelter, og hent billeder i hver passende kanal. Åbn billedanalysesoftwaren, og importer de billedfiler, der skal analyseres. Konverter billedet til gråtoneskala, adskil kanalerne, og begynd med at tærskel og oprette en binær maske af det forbehandlede billede.
Vælg Analyser, vælg derefter Angiv skala i rullemenuen, og angiv de relevante værdier for mikroskopiopsætningen. Gå derefter til indstilling af målinger, og vælg Område. Vælg analyser partikler ved hjælp af standardindstillingerne under fanen Analyser.
Hvis der er snavs i prøven, kan størrelsen eller cirkulariteten justeres for at bortfiltrere ikke-cellepartikler. Vælg Vis og derefter Konturer, så outputtet af filterud analyse vil omfatte en nummereret skitse af alle analyserede partikler. Eksporter målingerne til regnearkssoftware til yderligere analyse og graftegning.
De repræsentative fluorescensbilleder af hver eksperimentel behandling vises. Koncentration blandet kultur før spotting resulterede i afrundede eller forsvundne målceller over to timer, hvilket indikerer vellykket hæmning. Når den blandede kultur ikke er koncentreret, forbliver cellerne spredt på diaset.
Uden tilstrækkelig celle-til-celle kontakt hæmmes målstammen ikke af den dødelige stamme. Målcellerne forsvandt hverken eller blev afrundet, da de blev inkuberet med en T6SS-mutant under overfyldte eller spredte forhold. Således var målet uhæmmet i begge behandlinger.
Partikelanalyseresultaterne blev afbildet og analyseret for både målbelastning og hæmmerstamme. Større end 100 % af det oprindelige målområde ved sidste tidspunkt repræsenterer en nettostigning i målet, og under 100 % af det oprindelige målområde indikerede et nettofald i målet. Nettovæksten af hæmmerstammen blev observeret på tværs af alle behandlinger.
Men, procentdelen af det oprindelige område for inhibitor stamme var betydeligt højere, når en vild-type hæmmer blev co-inkuberet med målet i overfyldte forhold i forhold til alle andre behandlinger. For at få klare billeder skal agarosepuden være så flad som muligt. Skær tape stykker, før vikle dem rundt om diaset for at sikre, at de er af samme længde.
