Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

نشكر الدكتور أ. تزاغولوف (جامعة كولومبيا) على توفير الأجسام المضادة التي أثيرت ضد بروتينات علامة submitochondrial Cyt. b2، αKGD، وسكو1. ونشكر أيضا الدكتور ماريو هنريك دي باروس (جامعة ساو باولو) على المناقشات والتعليقات المفيدة أثناء وضع هذا البروتوكول.
وقد دعم هذا العمل منح بحثية من مؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado de São Paulo (منحة 2013/07937-8).
فرناندو غوميز وهيلينا تورانو مدعومان أيضا من قبل FAPESP، المنح 2017/09443-3 و 2017/23839-7 على التوالي. كما تحظى أنجيليكا راموس بدعم من كورديناساو دي أبيرفيسوامنتو دي بيسوال دي نيفل سوبيريور (CAPES).

1. نمو خلايا الخميرة
<ol><li>عزل مستعمرات واحدة من سلالة من الاهتمام عن طريق streaking جزء صغير من الخلايا من الأسهم -80 درجة مئوية الجلسرين على YPD (1٪ استخراج الخميرة، 2٪ بيبتون، 2٪ الجلوكوز) لوحة أجار. احتضان لوحة في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. ملاحظة: مشتق سلالة S. cerevisiae المستخدمة في هذا البروتوك...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importing+mitochondrial+proteins:+machineries+and+mechanisms.">Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms.</a> Cell. 138 (4), 628-644 (2009).</li><li>Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import:+from+proteomics+to+functional+mechanisms.">Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).</li><li>Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+proteome+and+human+disease.">The mitochondrial proteome and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).</li><li>Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+yeast+mitochondrial+proteome:+Multidimensional+separation+techniques+for+mitochondrial+proteomics.">Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).</li><li>Sickmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteome+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria.">The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).</li><li>V&#246;gtle, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+submitochondrial+protein+distribution.">Landscape of submitochondrial protein distribution.</a> Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+a+high-confidence+mitochondrial+proteome+at+quantitative+scale.">Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale.</a> Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).</li><li>Zahedi, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).</li><li>Gomes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+by+the+inner+membrane+peptidase+(IMP)+complex+or+Oct1+peptidase+controls+the+localization+of+the+yeast+peroxiredoxin+Prx1+to+distinct+mitochondrial+compartments.">Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+Application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Glick, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+c1+and+b2+are+sorted+to+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria+by+a+stop-transfer+mechanism.">Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism.</a> Cell. 69 (5), 809-822 (1992).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

وقد تم استخدام البروتوكول المعروض هنا بنجاح وتحسينه باستمرار لفترة طويلة لتحديد توطين البروتين في مقصورات الخضوع للشهية13,14,18,21,22,23. تعتمد موثوقية هذا البروتوكول وقابليته لإعادة ا?...

الميتوكوندريا هي العضيات الأساسية للخلايا eukaryotic التي تلعب أدوارا حاسمة في الجيوجيستيك الحيوية، والتمثيل الغذائي الخلوي، ومسارات الإشارات1. لتنفيذ هذه المهام بشكل صحيح، تعتمد الميتوكوندريا على مجموعة فريدة من البروتينات والدهون المسؤولة عن بنيتها ووظيفتها. وقد استخدمت الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae على نطاق واسع كنظام نموذجي للتحقيقات في عمليات الميتوكوندريا، وكذلك ل organelles2 أخرى. رموز الجينوم الميتوكوندريا لثمانية بروتينات فقط في الخميرة. يتم ترميز الغالبية العظمى من بروتينات الميتوكوندريا (~99٪) بواسطة الجينات النووية، والتي تترجم على الريبوسومات السيتوسولية، ويتم استيرادها بعد ذلك إلى مقصوراتها ال submitochondrial الصحيحة بواسطة آلات استيراد البروتين المتطورة3،4،5. وهكذا، يعتمد التكوين الحيوي الميتوكوندريا على التعبير المنسق لكل من الجينوم النووي والميتوكوندريا6,7. ترتبط الطفرات الوراثية المسببة لعيوب في التكوين الحيوي الميتوكوندريا بالأمراض البشرية8,9,10.
في العقدين الماضيين، أسفرت الدراسات البروتيومية عالية الإنتاجية التي تستهدف الميتوكوندريا عالية النقاء عن توصيف شامل للبروتيوم الميتوكوندريا الخميرة، والتي قدرت أن تتكون من ما لا يقل عن 900 البروتينات11،12،13،14. على الرغم من أن هذه الدراسات قدمت معلومات قيمة، فإن توطين شبه العضوية لكل بروتين في الأقسام الفرعية الأربعة للميتوكوندريا، وهي الغشاء الخارجي (OM)، والفضاء بين الميمبران (IMS)، والغشاء الداخلي (IM)، والمصفوفة، لا يزال مطلوبا. وقد عولجت هذه المسألة جزئيا مع دراسات على نطاق بروتيوميك من اثنين من أصغر الإدارات الفرعية الميتوكوندريا (OM وIMS)15,16. وفي الآونة الأخيرة، خطت شركة Vögtle والمتعاونون معها خطوة كبيرة إلى الأمام من خلال إنشاء خريطة عالمية عالية الجودة لتوزيع البروتين البروبوسوندري في الخميرة. باستخدام نهج متكامل يجمع بين قياس الطيف الكتلي الكمي القائم على SILAC ، وبروتوكولات الكسر الإرسالي المختلفة ، ومجموعة البيانات من OM وIMS proteomes ، خصص المؤلفون 818 بروتينا في الأقسام الفرعية الأربعة للميتوكوندريا13.
على الرغم من التقدم الذي حققته هذه الدراسات البروتيومية عالية الإنتاجية ، فإن معرفتنا حول تكوين البروتيوم البروتيومي البروتيدري أبعد ما تكون عن الاكتمال. في الواقع، من بين 986 البروتينات التي ذكرت من قبل Vögtle والمتعاونين بأنها مترجمة في الميتوكوندريا الخميرة، لا يمكن تعيين 168 في أي من المقصورات submitochondrial الأربعة13. وعلاوة على ذلك، لم يقدم المؤلفون معلومات حول طوبولوجيا الأغشية من البروتينات التي كان من المتوقع أن تكون مرتبطة هامشيا إلى محيط الأغشية الميتوكوندريا. على سبيل المثال، لا يمكن معرفة ما إذا كان البروتين الذي تم تعيينه كبروتين متصل بشكل هامشي بالغشاء الداخلي يواجه المصفوفة أو الفضاء بين الغشاء. وبصرف النظر عن هذه البيانات المفقودة من الدراسات على نطاق البروتيوم، هناك معلومات متضاربة حول توطين شبه العضوية لعدد كبير من بروتينات الميتوكوندريا. ومن الأمثلة على ذلك البروتياز Prd1، الذي تم تعيينه كبروتين فضائي بين الميمبران في قواعد البيانات المشتركة مثل قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces (SGD) وUniprot. من المستغرب ، وذلك باستخدام بروتوكول الانكسار مماثلة لتلك الموصوفة هنا ، Vögtle والمتعاونين أظهرت بوضوح أن Prd1 هو بروتين مصفوفة حقيقية13. كما ذكر أعلاه، يجب توضيح توطين العديد من بروتينات الميتوكوندريا أو إعادة تقييمه. هنا، ونحن نقدم بروتوكول بسيط وموثوق بها لتحديد توطين suborganellar من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة. تم تطوير هذا البروتوكول وتحسينه من قبل مجموعات بحثية مختلفة وتم استخدامه بشكل روتيني لتحديد توطين ال submitochondrial ، وكذلك طوبولوجيا الغشاء للعديد من بروتينات الميتوكوندريا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

على الرغم من التقدم الأخير في توصيف بروتيوم الميتوكوندريا الخميرة، وتوطين submitochondrial لعدد كبير من البروتينات لا يزال بعيد المنال. هنا، ونحن نصف طريقة قوية وفعالة لتحديد توطين suborganellar من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة، والتي تعتبر خطوة أساسية خلال توضيح وظيفة البروتين الميتوكوندريا. هذه الطريقة تنطوي على خطوة الأولية التي تتكون من الحصول على الميتوكوندريا سليمة نقية للغاية. ثم تخضع هذه الاستعدادات الميتوكوندريا لبروتوكول الانكسار الذي يتكون من صدمة نقصوتونية (تورم) والحضانة مع البروتين K (بروتياز). أثناء التورم ، يتم تعطيل غشاء الميتوكوندريا الخارجي بشكل انتقائي ، مما يسمح للبروتيناز K بهضم بروتينات مقصورة الفضاء بين الميمبران. في موازاة ذلك، للحصول على معلومات حول طوبولوجيا بروتينات الأغشية، يتم في البداية سونيكاتيد الاستعدادات الميتوكوندريا، ومن ثم تتعرض لاستخراج القلوية مع كربونات الصوديوم. وأخيرا ، بعد الطرد المركزي ، يتم تحليل الكسور الحبيبية والناسخة من هذه العلاجات المختلفة من قبل SDS-PAGE ولطخة غربية. يتم الحصول على توطين submitochondrial وكذلك طوبولوجيا الغشاء من البروتين من الفائدة من خلال مقارنة ملفها الشخصي وصمة عار الغربية مع المعايير المعروفة.

نجاح بروتوكول الكسر submitochondrial يعتمد على الحصول على الميتوكوندريا سليمة تنقية عالية. لهذا، فمن الضروري أنه خلال تحلل الخلية الخميرة، والحفاظ على سلامة العضيات تقريبا تماما. ويتحقق ذلك باستخدام بروتوكول تحلل الخلية الذي يجمع بين الهضم الأنزيمي لجدار الخلية يليه اضطراب مادي في غشاء البلازم...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

على الرغم من التقدم الأخير، العديد من البروتينات الميتوكوندريا الخميرة لا تزال مع وظائفها غير معروف تماما. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة وموثوقة لتحديد توطين البروتينات في الخلايا الراسية، والتي كانت أساسية لتوضيح وظائفها الجزيئية.

تقييم توطين البروتين Submitochondrial في الخميرة الناشئة Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد توطين submitochondrial من بروتينات الميتوكوندريا الخميرة، والتي تعتبر خطوة أساسية خلال توضيح وظيفة البروتين الميتوكوندريا. البروتوكول مناسب لسلالات الخميرة لدينا الحفاظ عليها في ظروف النمو المختلفة. تمثل أداة قوية للبحث ودراسة الميتوكوندريا.لتبدأ, سلسلة خلايا من مخزون الجلسرين المخزنة في 80 C, على لوحة أجار YPD لعزل مستعمرات واحدة من سلالة من الاهتمام. واحتضان لوحة في 30 C لمدة 2 إلى 3 أيام. إعداد ثقافة بداية عن طريق تلقيح 2 إلى 3 مستعمرات فردية من لوحة أجار YPD في قارورة Erlenmeyer 100 مل تحتوي على 10 إلى 30 مل من المتوسط YPGal.احتضان القارورة في 30 C لمدة 24 ساعة مع اهتزاز قوي في 180 إلى 200 دورة في الدقيقة. تمييع ثقافة المبتدئين إلى 1 لتر من متوسط YPGal الطازج إلى كثافة بصرية أقل من 0.1 في 600 نانومتر. زراعة الخلايا في 30 C مع اهتزاز قوي في 180 إلى 200 دورة في الدقيقة لمدة 12 ساعة تقريبا، حتى تصل الكثافة البصرية 1 إلى 1.5.تنفيذ عزل الميتوكوندريا تنقية عالية كما هو موضح في النص. وتحديد تركيز البروتين من إعداد الميتوكوندريا تنقية عالية، وذلك باستخدام المقايسة برادفورد، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ضبط تركيز البروتين إلى 10 ملغ / مل مع الجليد الباردة SEM العازلة.نقل 40 لتر من الميتوكوندريا عالية النقاء إلى أربعة 1.5 مل قبل المبردة والمسمي أنابيب الطرد المركزي الدقيق. إضافة 360 لتر من المخزن المؤقت SEM في الأنابيب الأولى والثانية. و 360 لتر من العازلة EM في الأنابيب الثالثة والرابعة.باستخدام مخطط pipetting، وفقا للنص، إضافة 4 لتر من البروتين الطازج K في الأنبوب الثاني والرابع. بعد خلط جميع الأنابيب بلطف، احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة مع خلط عرضية. لوقف نشاط البروتين K إضافة 4 لتر من 200 م م PMSF لجميع الأنابيب الأربعة.الطرد المركزي الأنابيب في 20, 000 س غ لمدة 30 دقيقة في 4 C.وجمع supernatant, دون إزعاج بيليه, في أنبوب جديد 1.5 مل المبردة مسبقا المسمى الطرد المركزي. بعد ذلك ، resuspend بيليه في 400 لتر من الجليد الباردة SEM العازلة. لتثبيط الآثار المحتملة للبروتيناز K، يعجل الناطقات التي تم جمعها وإعادة إنفاق بيليه مع حمض ثلاثي الكلور إلى تركيز نهائي من 10٪ احتضان الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق.الطرد المركزي حمض ثلاثي الكلور الأسيتيك تعامل عينات لمدة 10 دقائق في 12، 000 x ز في 4 C.And بعد إزالة supernatant، resuspend بيليه في 200 لتر من العازلة عينة. إذا تحول اللون الأزرق بروموفينول الأصفر، إضافة 1 إلى 5 لتر من قاعدة تريس 1 M، حتى يتحول الأزرق. إضافة 4 لتر من 200 م م PMSF لجميع الأنابيب.تخزين العينات في 80 C حتى مزيد من التحليل من قبل SDS-PAGE ولطخة الغربية. نقل 200 لتر من الميتوكوندريا تنقية عالية في أنبوب 1.5 مل قبل المبردة الطرد الدقيق. تمييع الميتوكوندريا مرة واحدة مع عازلة SEM الباردة الجليد.باستخدام sonicator متوافقة مع وحدات التخزين الصغيرة، سونيكاتي الميتوكوندريا 3 مرات لمدة 30 ثانية على الجليد. طرد مركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 100، 000 x ز في 4 C.وجمع supernatant في أنبوب جديد 1.5 مل قبل المبردة الطرد المركزي. بعد وضع علامة على الأنبوب باسم S "لجزء البروتين القابل للذوبان ، حافظ على الأنبوب على الجليد.Resuspend بيليه من الخطوة السابقة في 400 لتر من الجليد الباردة SEM العازلة. نقل 100 لتر من بيليه resuspended في أنبوب جديد 1.5 مل قبل المبردة الطرد المركزي. تسمية أنبوب كما SMP "للجسيمات submitochondrial كسر، والحفاظ على أنبوب على الجليد.تمييع المتبقية 300 لتر من بيليه resuspended مرة واحدة مع الطازجة أعدت 200 mM كربونات الصوديوم. واحتضان العينة المخففة على الجليد لمدة 30 دقيقة. ثم، طرد مركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 100، 000 × ز في 4 C.Collect الناتة في أنبوب جديد 1.5 مل من أجهزة الطرد المركزي الصغيرة المبردة مسبقا.تسمية العينة باسم CS "لكسر الكربونات الفائقة، والحفاظ على أنبوب على الجليد. Resuspend بيليه من الخطوة السابقة في 400 لتر من الجليد الباردة SEM العازلة. واسم العينة باسم CP "للكسر المرسب الكربونات.عجل جميع العينات مع حمض ثلاثي الكلور إلى تركيز النهائي من 10٪واحتضان الأنابيب على الجليد لمدة 10 دقائق. ثم، الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقائق في 12، 000 x ز في 4 C.After إزالة supernatant، resuspend كل بيليه في المخزن المؤقت العينة. إذا أصبح المخزن المؤقت عينة صفراء، إضافة 1 إلى 5 لتر من قاعدة 1 M تريس حتى يتحول إلى اللون الأزرق.إضافة 1 لتر من 200 م م PMSF إلى جميع الأنابيب وتخزينها في 80 C حتى مزيد من التحليل من قبل SDS-PAGE ولطخة الغربية. تم تنقية كسر الميتوكوندريا الخام على الطرد المركزي المتدرجة كثافة السكروز، ولوحظ انخفاض في الملوثات الخلوية الأخرى. تم رصد الميتوكوندريا لتحويل mitoplast عن طريق اختفاء بروتين الفضاء بين الميمبران cytochrome b2 في بيليه.مع المظهر المصاحب في الفائقة. وقد لوحظ تدهور البروتين K بوساطة من البروتين بين الميمبرين Sco1 بسبب اضطراب الغشاء الخارجي عن طريق الصدمة التناضحية. تم تأكيد سلامة غشاء الميتوكوندريا الخارجي من خلال حماية السيتوكروم B2 و Sco1 ضد تدهور البروتين K في جزء بيليه.وبالمثل، أكدت حماية البروتين القابل للذوبان مصفوفة KGD سلامة الغشاء الميتوكوندريا الداخلية. Prx1 الشخصية لطخة الغربية اقترح توطين الميتوكوندريا المزدوجة في الفضاء intermembrane ومصفوفة. تعرضت الميتوكوندريا ل sonication واستخراج الكربونات للتحقيق في طوبولوجيا بروتينات الأغشية.بقي البروتين الغشاء المتكاملة صب في الكسور بيليه. تم الكشف عن KGD في كسر فائقة. وكان الكشف عن بروتين KGD في بيليه بسبب الاختلافات معلمة سونيكيشن التي تؤثر على تشكيل الشركات الصغيرة والمتوسطة.بعد معالجة كربونات الصوديوم ، تم تليين KGD وكسر SMP ووجد في الكسر الفائق. Prx1 الشخصية لطخة الغربية اقترح وجود ارتباط مع محيط الغشاء. لنجاح بروتوكول الكسر التقدي، من المهم وقف نشاط البروتين K بعد تورم هيبوتونيك عن طريق إضافة PMSF إلى العينات.توفر المواقع معلومات حول توطين البروتين التقديمي. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضا للتحقق من سلامة الاستعدادات الميتوكوندريا ، وهو أمر أساسي أثناء الدراسات البروتيوميكية للأقسام الفرعية الميتوكوندريا.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

تقييم أثر تراكم البروتين في الأكسدة الخلوية في الخميرة

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

شاشة 2-هجين خميرة في دفعة المقارنة بين تفاعلات البروتين

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

التحليل الكمي للدهون الخلوية من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

استخدام Grafix للكشف عن المتفاعلات العابرة من Saccharomyces cerevisiae التشبيكليسومات الفرعية

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

وضع العلامات والتصور لمنتجات التعبير الجينوم الميتوكوندريا في خميرة بيكر Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

الأيض الكمي من Saccharomyces Cerevisiae باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

تحليل توليف الدهون المحايدة في Saccharomyces cerevisiae بواسطة وضع العلامات الأيضية وكروماتوغرافيا طبقة رقيقة

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

إعداد و Cryo-FIB micromachining من Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي كريو إلكترون

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...