Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Vi takker Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) for at give antistoffer rejst mod submitochondrial markør proteiner Cyt. b2, αKGD og Sco1. Vi takker også Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) for nyttige diskussion og kommentarer under oprettelsen af denne protokol.
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (tilskud 2013/07937-8).
Fernando Gomes og Helena Turano støttes også af FAPESP, giver henholdsvis 2017/09443-3 og 2017/23839-7. Angélica Ramos støttes også af Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

1. Vækst af gærceller
<ol><li>Isoler enkelte kolonier af stammen af interesse ved striber en lille del af cellerne fra en -80 ° C glycerol lager på en YPD (1% gær ekstrakt, 2% peptone, 2% glukose) agar plade. Pladen inkuberes ved 30 °C i 2-3 dage. BEMÆRK: Den S. cerevisiae stamme, der anvendes i denne protokol er afledt af BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Med undtagelse af de auxotrofiske markørgener...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importing+mitochondrial+proteins:+machineries+and+mechanisms.">Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms.</a> Cell. 138 (4), 628-644 (2009).</li><li>Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import:+from+proteomics+to+functional+mechanisms.">Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).</li><li>Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+proteome+and+human+disease.">The mitochondrial proteome and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).</li><li>Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+yeast+mitochondrial+proteome:+Multidimensional+separation+techniques+for+mitochondrial+proteomics.">Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).</li><li>Sickmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteome+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria.">The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).</li><li>V&#246;gtle, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+submitochondrial+protein+distribution.">Landscape of submitochondrial protein distribution.</a> Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+a+high-confidence+mitochondrial+proteome+at+quantitative+scale.">Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale.</a> Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).</li><li>Zahedi, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).</li><li>Gomes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+by+the+inner+membrane+peptidase+(IMP)+complex+or+Oct1+peptidase+controls+the+localization+of+the+yeast+peroxiredoxin+Prx1+to+distinct+mitochondrial+compartments.">Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+Application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Glick, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+c1+and+b2+are+sorted+to+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria+by+a+stop-transfer+mechanism.">Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism.</a> Cell. 69 (5), 809-822 (1992).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

Protokollen, der præsenteres her, er blevet brugt med succes og løbende optimeret i lang tid til at bestemme proteinaaliseringen i indsenderokondrierummene13,14,18,21,22,23. Pålideligheden og reproducerbarheden af denne protokol er stærkt afhængig af renheden og integriteten af mitokondriepræparater18....

Mitokondrier er essentielle organeller af eukaryote celler, der spiller afgørende roller i bioenergetik, cellulære metabolisme, og signalering veje1. For korrekt at udføre disse opgaver er mitokondrier afhængige af et unikt sæt proteiner og lipider, der er ansvarlige for deres struktur og funktion. Den spirende gær Saccharomyces cerevisiae er blevet meget brugt som et modelsystem til undersøgelser af mitokondrieprocesser samt til andre organeller2. Mitokondriegenomkoderne for kun otte proteiner i gær; langt de fleste mitokondrieproteiner (~99%) er kodet af nukleare gener, som oversættes på cytosoliske ribosomer og efterfølgende importeres til deres korrekte indsendelsesrum af avancerede proteinimportmaskiner3,4,5. Mitokondriebiogenese afhænger således af det koordinerede udtryk for både det nukleare og mitokondriegenomer6,7. Genetiske mutationer forårsager defekter i mitokondrie biogenese er forbundet med menneskelige sygdomme8,9,10.
I de sidste to årtier, high-throughput proteomiske undersøgelser rettet mod stærkt renset mitokondrier resulterede i en omfattende karakterisering af gær mitokondrie proteom, som er blevet anslået til at bestå af mindst 900 proteiner11,12,13,14. Selv om disse undersøgelser gav værdifulde oplysninger, er suborganellar lokalisering af hvert protein i de fire mitokondrie subcompartments, nemlig den ydre membran (OM), intermembrane rum (IMS), indre membran (IM) og matrix, stadig påkrævet. Dette spørgsmål blev delvis behandlet med proteomiske undersøgelser af de to mindre mitokondrieunderkomplekser (OM og IMS)15,16. For nylig tog Vögtle og samarbejdspartnere et stort skridt fremad ved at generere et globalt kort af høj kvalitet over indsendelse af proteiner i gær. Ved hjælp af en integreret tilgang, der kombinerer SILAC-baseret kvantitativ massespektrometri, forskellige submitochondriale fraktioneringsprotokoller og datasættet fra OM- og IMS-proteomerne, tildelte forfatterne 818 proteiner i de fire mitokondrieunderkommandoer13.
På trods af de fremskridt, der er opnået ved disse højgennemsigtede proteomiske undersøgelser, er vores viden om indsendelsesproktørrieproteomsammensætningen langt fra afsluttet. Faktisk, blandt 986 proteiner rapporteret af Vögtle og samarbejdspartnere som værende lokaliseret til gær mitokondrier, 168 kunne ikke tildeles i nogen af de fire submitochondrial rum13. Desuden gav forfatterne ikke oplysninger om membranetopologien af proteiner, der blev forudsagt at være perifert fastgjort til periferien af mitokondriemembraner. For eksempel er det ikke muligt at vide, om et protein, der blev tildelt som perifert fastgjort til den indre membran, vender mod matrixen eller intermembranrummet. Bortset fra disse manglende data fra proteom-dækkende undersøgelser, der er modstridende oplysninger om suborganellar lokalisering af et betydeligt antal mitokondrie proteiner. Et eksempel er protease Prd1, som er blevet tildelt som et intermembrane rumprotein i de fælles databaser som Saccharomyces Genome Database (SGD) og Uniprot. Overraskende nok viste Vögtle og samarbejdspartnere ved hjælp af en underfraktioneringsprotokol svarende til den, der er beskrevet her, klart, at Prd1 er et ægte matrixprotein13. Som nævnt ovenfor skal indsendeokondrial lokalisering af mange mitokondrieproteiner belyses eller revurderes. Her giver vi en enkel og pålidelig protokol til bestemmelse af suborganellar lokalisering af gær mitokondrieproteiner. Denne protokol blev udviklet og optimeret af forskellige forskningsgrupper og er rutinemæssigt blevet brugt til at bestemme underkastelsesplaceringen samt membrantopologien af mange mitokondrieproteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

På trods af de seneste fremskridt i karakteriseringen af gær mitokondrie proteom, er indsendelsenokondrial lokalisering af et betydeligt antal proteiner stadig undvigende. Her beskriver vi en robust og effektiv metode til bestemmelse af suborganellar lokalisering af gær mitokondrieproteiner, som betragtes som et grundlæggende skridt under mitokondrieproteinfunktionsudredning. Denne metode indebærer et første skridt, der består i at opnå meget ren intakt mitokondrier. Disse mitokondriepræparater underkastes derefter en subfraktioneringsprotokol bestående af hypotonchok (hævelse) og inkubation med proteinase K (protease). Under hævelse forstyrres den ydre mitokondriemembran selektivt, så proteinase K kan fordøje proteiner i intermembranumrummet. Parallelt, for at få oplysninger om topologien af membranproteiner, bliver mitokondriepræparaterne oprindeligt sonikeret og udsættes derefter for alkalisk ekstraktion med natriumcarbonat. Endelig, efter centrifugering, pellet og supernatant fraktioner fra disse forskellige behandlinger analyseres af SDS-PAGE og vestlige blot. Den submitochondriale lokalisering samt membranen topologi af protein af interesse opnås ved at sammenligne sin vestlige blot profil med kendte standarder.

Succesen af submitochondrialfraktionering protokol afhænger af at opnå stærkt renset intakt mitokondrier. Til dette er det vigtigt, at under gærcellelyset forbliver organellernes intakthed næsten helt bevaret. Dette opnås ved hjælp af en celle lysis protokol, der kombinerer enzymatisk fordøjelse af cellevæggen efterfulgt af fysisk forstyrrelse af plasmamembranen ved hjælp af en Dounce homogenizer. Mitokondrieindholdet opsamles derefter ved differentialcentrifugering. Denne subcellulære fraktionering giver en b...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

På trods af de seneste fremskridt, mange gær mitokondrie proteiner stadig med deres funktioner helt ukendt. Denne protokol giver en enkel og pålidelig metode til at bestemme underkastelsesalisering af proteiner, som har været grundlæggende for udredningen af deres molekylære funktioner.

Vurdering af indsendeokondrial protein lokalisering i spirende gær saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Denne protokol er designet til at bestemme underkastelsesalisering af gær mitokondrieproteiner, som betragtes som et grundlæggende skridt under mitokondrieproteinfunktionsudredning. Protokollen er velegnet til vores gærstammer, der opretholdes under forskellige vækstbetingelser. Repræsenterer et kraftfuldt værktøj til forskning som studerer mitokondrier.Til at begynde med, streak celler fra glycerol lager opbevaret ved 80 C, på en YPD agar plade til at isolere enkelte kolonier fra stammen af interesse. Og inkubere pladen ved 30 C i 2 til 3 dage. Forbered en startkultur ved at pode 2 til 3 individuelle kolonier fra YPD agarplade i en 100 ml Erlenmeyer kolbe indeholdende 10 til 30 ml YPGal medium.Kolben inkuberes ved 30 C i 24 timer med kraftig rysten ved 180 til 200 omdrejninger. Fortynd startkulturen til 1 L frisk YPGal medium til en optisk densitet mindre end 0,1 ved 600 nm. Dyrk cellerne ved 30 C med kraftig rysten ved 180 til 200 omdrejninger i ca. 12 timer, indtil den optiske tæthed når 1 til 1,5.Udfør isolering af højt renset mitokondrier som beskrevet i teksten. Og bestemme proteinkoncentrationen af det stærkt rensede mitokondriepræparat ved hjælp af Bradford-analysen, efter producentens anvisninger. Proteinkoncentrationen justeres til 10 mg/ml med iskold SEM-buffer.40 l stærkt renset mitokondrier overføres til fire 1,5 ml forkølede og mærkede mikrocentrifugrør. Tilsæt 360 l SEM-buffer i første og andet rør. Og 360 l EM buffer i tredje og fjerde rør.Ved hjælp af pipetterordningen tilsættes 4 L frisklavet proteinase K i andet og fjerde rør i det andet og fjerde rør. Efter at have blandet alle rørene forsigtigt, inkuberes på is i 30 minutter med lejlighedsvis blanding. For at stoppe proteinase K aktivitet tilføje 4 L af 200 mM PMSF til alle fire rør.Centrifugere rørene ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 c.Og saml supernatanten, uden at forstyrre pellet, i en ny 1,5 ml forkølet mærket mikrocentrifuge rør. Dernæst genbruges pellet i 400 l iskold SEM buffer. For at inaktivere de mulige spor af proteinase K skal du udfælde det opsamlede supernatant og genbruge pelleten med trichloreddikesyre til en endelig koncentration på 10% Inkubere rørene på is i 10 minutter.Centrifuge de trichloreddikesyrebehandlede prøver i 10 minutter ved 12.000 x g ved 4 C.Og efter fjernelse af supernatanten skal pellet genbruges i 200 l prøvebuffer. Hvis bromophenolblå bliver gul, skal du tilføje 1 til 5 l af 1 M Tris base, indtil den bliver blå. Tilsæt 4 l 200 mM PMSF til alle rørene.Opbevar prøverne ved 80 C indtil yderligere analyse af SDS-PAGE og western blot. 200 l stærkt renset mitokondrier overføres til et 1,5 ml forkølet mikrocentrifugerør. Fortynd mitokondrier én gang med iskold SEM buffer.Ved hjælp af en soniker kompatibel med små mængder, sonikere mitokondrier 3 gange i 30 sekunder på is. Prøven centrifugeres i 30 minutter ved 100.000 x g ved 4 c.Og saml supernatanten i et nyt 1,5 ml forkølet mikrocentrifugerør. Når røret er mærket som S"for opløselig proteinfraktion, skal røret holdes på is.Brugpillen igen fra forrige trin i 400 l iskold SEM-buffer. 100 l af den ophængte pellet overføres til et nyt 1,5 ml forkølet mikrocentrifugrør. Mærk røret som SMP"for submitochondrial partikler fraktion, og holde røret på is.Fortynd de resterende 300 l resuspended pellet en gang med frisklavet 200 mM natriumcarbonat. Og inkubere den fortyndede prøve på is i 30 minutter. Derefter centrifugere prøven i 30 minutter ved 100,000 x g ved 4 C.Saml supernatanten i et nyt 1,5 ml forkølet mikrocentrifugerør.Mærk prøven som CS"for karbonat supernatantfraktion, og hold røret på is. Brugpillen igen fra forrige trin i 400 l iskold SEM-buffer. Og navngive prøven som CP "for karbonat udfældet fraktion.Udfælde alle prøverne med trichloreddikesyre til en endelig koncentration på 10% og inkubere rørene på is i 10 minutter. Derefter centrifugere prøverne i 10 minutter ved 12.000 x g ved 4 C.Efter fjernelse af supernatanten skal hver pille tages i prøvebufferen igen. Hvis prøvebufferen bliver gul, skal der tilsættes 1 til 5 l 1 M Tris-base, indtil den bliver blå.Tilføj 1 l af 200 mM PMSF til alle rør og opbevares ved 80 C indtil yderligere analyse af SDS-PAGE og vestlige blot. Den rå mitokondriefraktion blev renset på saccharosetæthedsgradgradientcentrifugering, og reduktion i andre cellulære forurenende stoffer blev observeret. Mitokondrier til mitoplastkonvertering blev overvåget af forsvinden af intermembrane rumproteinet cytochrom b2 i pelleten.Med det samtidige udseende i supernatanten. Proteinase K medieret nedbrydning af intermembran protein Sco1 blev observeret på grund af ydre membranforstyrrelse ved osmotisk chok. Den ydre mitokondriemembran integritet blev bekræftet ved beskyttelse af cytochrom b2 og Sco1 mod proteinase K nedbrydning i pellet fraktion.På samme måde bekræftede beskyttelsen af det matrixopløselige protein KGD den indre mitokondriemembranintegritet. Prx1 western blot profil foreslog dobbelt mitokondrie lokalisering i intermembrane rum og matrix. Mitokondrier blev udsat for sonikering og karbonatudvinding for at undersøge topologien af membranproteiner.Den integrerede membran protein hælde forblev i pellet fraktioner. KGD'en blev fundet i supernatantfraktionen. Påvisning af KGD-protein i pellet skyldtes sonikeringsparametervariationer, der påvirkede dannelsen af SMPs.Efter natriumcarbonatbehandlingen blev KGD og SMP-fraktionen opløset og fundet i supernatantfraktionen. Prx1 western blot profil foreslog en sammenhæng med membran periferien. For succesen af submitochondrialfraktioneringsprotokollen er det vigtigt at stoppe proteinase K-aktivitet efter hypotonisk hævelse ved at tilføje PMSF til prøverne.Websteder giver oplysninger om lokalisering af indsendende proteiner. Denne protokol kan også bruges til at kontrollere integriteten af mitokondriepræparater, som er grundlæggende under proteomiske undersøgelser af mitokondrieundercompartments.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantificering af oversættelse i spirende gær af ribosomet profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Evaluering af virkningen af Protein aggregering på cellulært Oxidative Stress i gær

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

En gær 2-Hybrid skærm i Batch for at sammenligne Protein interaktioner

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse af cellulære lipidom af Saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Udnyttelse af grafix til påvisning af forbigående interactorer af saccharomyces cerevisiae splejsning splejsstoffer

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mærkning og visualisering af mitokondriegenomudtryksprodukter i Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitative metabolomics af saccharomyces Cerevisiae Ved hjælp af flydende kromatografi kombineret med tandem massespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse af neutral lipidsyntese i Saccharomyces cerevisiae ved metabolisk mærkning og tyndt lag kromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og kryo-FIB mikromaskiner af Saccharomyces cerevisiae til Kryo-Elektron Tomografi

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...