Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

אנו מודים לד"ר א. ציגלוף (אוניברסיטת קולומביה) על אספקת נוגדנים שהועלו כנגד חלבוני סמן קשירת ים Cyt. b2, αKGD וסקו1. אנו מודים גם לד"ר מריו הנריקה דה בארוס (Universidade de São Paulo) על דיון והערות מועילות במהלך הקמת פרוטוקול זה.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (grant 2013/07937-8).
פרננדו גומס והלנה טוראנו נתמכים גם על ידי FAPESP, מענקים 2017/09443-3 ו 2017/23839-7, בהתאמה. Angélica Ramos נתמך גם על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

1. צמיחה של תאי שמרים
<ol><li>לבודד מושבות בודדות של זן העניין על ידי פסים חלק קטן של התאים מ -80 °C מלאי גליסול על YPD (1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% גלוקוז) צלחת אגר. לדגור על הצלחת ב 30 °C (50 °F) במשך 2-3 ימים. הערה: זן S. cerevisiae המשמש בפרוטוקול זה נגזר על ידי BY4741 (MATα; שלו3Δ1; leu2Δ0; <em...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importing+mitochondrial+proteins:+machineries+and+mechanisms.">Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms.</a> Cell. 138 (4), 628-644 (2009).</li><li>Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import:+from+proteomics+to+functional+mechanisms.">Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).</li><li>Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+proteome+and+human+disease.">The mitochondrial proteome and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).</li><li>Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+yeast+mitochondrial+proteome:+Multidimensional+separation+techniques+for+mitochondrial+proteomics.">Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).</li><li>Sickmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteome+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria.">The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).</li><li>V&#246;gtle, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+submitochondrial+protein+distribution.">Landscape of submitochondrial protein distribution.</a> Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+a+high-confidence+mitochondrial+proteome+at+quantitative+scale.">Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale.</a> Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).</li><li>Zahedi, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).</li><li>Gomes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+by+the+inner+membrane+peptidase+(IMP)+complex+or+Oct1+peptidase+controls+the+localization+of+the+yeast+peroxiredoxin+Prx1+to+distinct+mitochondrial+compartments.">Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+Application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Glick, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+c1+and+b2+are+sorted+to+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria+by+a+stop-transfer+mechanism.">Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism.</a> Cell. 69 (5), 809-822 (1992).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

הפרוטוקול המוצג כאן נעשה שימוש מוצלח ואופטימיזציה רציפה במשך זמן רב כדי לקבוע את לוקליזציה חלבון בתאי submitochondrial13,14,18,21,22,23. האמינות והשחזור של פרוטוקול זה תלויים מאוד בטוהר ושלמות ה...

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אאוקריוטים הממלאים תפקידים מכריעים בביו-אנרגטיקה, חילוף חומרים תאי ומסלולי איתות1. כדי לבצע כראוי משימות אלה, המיטוכונדריה מסתמכת על קבוצה ייחודית של חלבונים ושומנים האחראים על המבנה והתפקוד שלהם. שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל עבור חקירות על תהליכים מיטוכונדריאליים, כמו גם עבור אברונים אחרים2. קודי הגנום המיטוכונדריאליים לשמונה חלבונים בלבד בשמרים; הרוב המכריע של החלבונים המיטוכונדריאליים (כ-99%) מקודדים על ידי גנים גרעיניים, המתורגמים לריבוזומים ציטוזוליים, ולאחר מכן מיובאים לתאי השליחה הנכונים שלהם על ידי מכונות ייבוא חלבונים מתוחכמות3,4,5. לפיכך, ביוגנזה מיטוכונדריאלית תלויה בביטוי המתואם של הגנום הגרעיני והמיטוכונדריאלי6,7. מוטציות גנטיות הגורמות לפגמים בביוגנזה מיטוכונדריאלית קשורות למחלות אנושיות8,9,10.
בשני העשורים האחרונים, מחקרים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה המתמקדים במיטוכונדריה מטוהרת מאוד הביאו לאפיון מקיף של פרוטאום מיטוכונדריאלי שמרים, אשר הוערך כי הוא מורכב לפחות 900 חלבונים11,12,13,14. למרות שמחקרים אלה סיפקו מידע רב ערך, לוקליזציה תת-אורגנית של כל חלבון בארבעת תתי-הדירות המיטוכונדריאליות, כלומר, הממברנה החיצונית (OM), המרחב הבין-משרדי (IMS), הממברנה הפנימית (IM) והמטריקס, עדיין נדרשת. שאלה זו טופלה בחלקה במחקרים פרוטאומיים של שתי תתי-התת-קומפרטציות המיטוכונדריאליות הקטנות יותר (OM ו- IMS)15,16. לאחרונה, Vögtle ומשתפי פעולה עשו צעד גדול קדימה על ידי יצירת מפה גלובלית באיכות גבוהה של הפצת חלבון submitochondrial בשמרים. באמצעות גישה משולבת המשלבת ספקטרומטריית מסה כמותית מבוססת SILAC, פרוטוקולי שברים שונים של submitochondrial, ואת ערכת הנתונים מפרוטומים OM ו- IMS, המחברים הקצו 818 חלבונים לארבעת תתי-ההפרשות המיטוכונדריאליות13.
למרות ההתקדמות שהושגו על ידי מחקרים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה אלה, הידע שלנו על הרכב הפרוטאום ההגשה רחוק מלהיות שלם. ואכן, בין 986 חלבונים שדווחו על ידי Vögtle ומשתפי פעולה כמו להיות מקומי לתוך מיטוכונדריה שמרים, 168 לא יכול להיות מוקצה בכל אחד מארבעת התאים submitochondrial13. יתר על כן, המחברים לא סיפקו מידע על טופולוגיית הממברנה של חלבונים שהיו צפויים להיות מחוברים באופן היקפי לפריפריה של ממברנות מיטוכונדריאליות. לדוגמה, לא ניתן לדעת אם חלבון שהוקצה כמו מחובר היקפית לממברנה הפנימית פונה למטריצה או לחלל הבין-משרדי. מלבד נתונים חסרים אלה ממחקרים ברחבי פרוטאום, ישנם מידע סותר על לוקליזציה תת-אורגנית של מספר משמעותי של חלבונים מיטוכונדריאליים. דוגמה אחת היא פרוטאז Prd1, אשר הוקצה כחלבון חלל בין-משרדי במסדי הנתונים הנפוצים כגון מסד נתונים גנום Saccharomyces (SGD) ו Uniprot. באופן מפתיע, באמצעות פרוטוקול תת-תרגול דומה לזה המתואר כאן, Vögtle ומשתפי פעולה הראו בבירור כי Prd1 הוא חלבון מטריצה אמיתי13. כפי שהוזכר לעיל, לוקליזציה גש של חלבונים מיטוכונדריאליים רבים צריך להיות מבורר או הערכה מחדש. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פשוט ואמין כדי לקבוע את לוקליזציה תת-אורגנית של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים. פרוטוקול זה פותח ואופטימיזציה על ידי קבוצות מחקר שונות, שימש באופן שגרתי כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial, כמו גם את טופולוגיית הממברנה של חלבונים מיטוכונדריאליים רבים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

למרות ההתקדמות האחרונה באפיון פרוטאום מיטוכונדריאלי שמרים, לוקליזציה submitochondrial של מספר משמעותי של חלבונים נשאר חמקמק. כאן, אנו מתארים שיטה חזקה ויעילה לקביעת לוקליזציה תת-אורגנית של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים, אשר נחשב צעד בסיסי במהלך הפרטרה פונקציית חלבון מיטוכונדריאלי. שיטה זו כרוכה בצעד ראשוני המורכב מהשגת מיטוכונדריה שלמה טהורה מאוד. תכשירים מיטוכונדריאליים אלה כפופים לאחר מכן לפרוטוקול תת-ניתוח המורכב מהלם היפוטוני (נפיחות) ודגירה עם פרוטאז K (פרוטאז). במהלך הנפיחות, הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית משובשת באופן סלקטיבי, ומאפשרת לחלבון-ase K לעכל חלבונים של תא החלל הבין-ימי. במקביל, כדי לקבל מידע על הטופולוגיה של חלבוני ממברנה, ההכנות המיטוכונדריאליות הם בתחילה sonicated, ולאחר מכן נתון מיצוי אלקליין עם נתרן קרבונט. לבסוף, לאחר צנטריפוגה, הכדור ושברים על טבעיים מטיפולים שונים אלה מנותחים על ידי SDS-PAGE וכתם מערבי. לוקליזציה submitochondrial, כמו גם את טופולוגיית הממברנה של חלבון העניין מתקבל על ידי השוואת פרופיל כתם המערבי שלה עם סטנדרטים ידועים.

ההצלחה של פרוטוקול הפירוק של ההגשה תלויה בהשגת מיטוכונדריה שלמה מטוהרת מאוד. בשביל זה, זה חיוני כי במהלך תמוגה תא שמרים, שלמות של organelles נשאר כמעט לחלוטין השתמר. זה מושגת באמצעות פרוטוקול תמוגה תא המשלב את העיכול אנזימטי של דופן התא ואחריו הפרעה פיזית של קרום הפלזמה באמצעות homogenizer Dounce. התוכן...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

פרוטוקול זה נועד לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים, אשר נחשב צעד בסיסי במהלך הפרטת פונקציית חלבון מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול מתאים לזני השמרים שלנו המתוחזקים בתנאי גדילה שונים. ייצוג כלי רב עוצמה למחקר כמו לימוד המיטוכונדריה.ראשית, תאי פסים ממלאי הגליצריול מאוחסנים ב 80 C, על צלחת אגר YPD כדי לבודד מושבות בודדות מן המתח של עניין. ודגרת הצלחת ב 30 C במשך 2 עד 3 ימים. הכן תרבות המתנע על ידי חנק 2 עד 3 מושבות בודדות מצלחת אגר YPD בבקבוק ארלנמאייר 100 מ"ל המכיל 10 עד 30 מ"ל של מדיום YPGal.לדגור על הבקבוקון ב 30 C במשך 24 שעות עם רועד נמרץ ב 180 עד 200 סל"ד. לדלל את תרבות המתנע לתוך 1 ליטר של בינוני YPGal טרי לצפיפות אופטית פחות מ 0.1 ב 600 ננומטר. לטפח את התאים ב 30 C עם רועד נמרץ ב 180 עד 200 סל"ד במשך כ 12 שעות, עד צפיפות אופטית מגיעה 1 עד 1.5.בצע את הבידוד של המיטוכונדריה המטוהרת ביותר כמתואר בטקסט. ולקבוע את ריכוז החלבון של הכנת המיטוכונדריה המטוהרת ביותר, באמצעות ברדפורד, בעקבות הוראות היצרן. התאם את ריכוז החלבון ל-10 מ"ג/מ"ל עם חוצץ SEM קר כקרח.מעבירים 40 ליטר של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד לארבעה צינורות מיקרוצנטריפוגה מצוננים מראש ומסומנים. הוסף 360 l של מאגר SEM בצינור הראשון והשני. ו-360 ליטר של חיץ EM בצינורות השלישי והרביעי.באמצעות ערכת pipetting, לפי הטקסט, להוסיף 4 ליטר של חלבון טרי מוכן K בצינור השני והרביעי. לאחר ערבוב כל הצינורות בעדינות, לדגור על קרח במשך 30 דקות עם ערבוב מדי פעם. כדי לעצור את פעילות proteinase K להוסיף 4 L של 200 mM PMSF לכל ארבעת הצינורות.צנטריפוגות הצינורות ב 20, 000 x g במשך 30 דקות ב 4 C.ולאסוף את supernatant, מבלי להפריע את הכדור, לתוך צינור microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל מקורר מראש. לאחר מכן, יש להזרים את הכדור ב-400 ליטר של חוצץ SEM קר כקרח. כדי לנטרל את העקבות האפשריים של פרוטאינאז K, לזרז את supernatant שנאסף מחדש את הכדור עם חומצה טריכלורואצטית לריכוז סופי של 10%לדגור על הצינורות על קרח במשך 10 דקות.צנטריפוגות חומצה טריכלורואצטית שטופלו דגימות במשך 10 דקות ב 12, 000 x g ב 4 C.ולאחר הסרת supernatant, resuspend הכדור ב 200 l של חוצץ מדגם. אם הכחול ברומופנול הופך צהוב, להוסיף 1 עד 5 l של בסיס טריס 1 M, עד שהוא הופך כחול. הוסף 4 l של 200 mM PMSF לכל הצינורות.אחסן את הדגימות ב 80 C עד ניתוח נוסף על ידי SDS-PAGE ו כתם מערבי. מעבירים 200 ליטר של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד לצינור מיקרוצנטריפוגה מצונן מראש של 1.5 מ"ל. לדלל את המיטוכונדריה פי אחד עם חוצץ SEM קר כקרח.באמצעות sonicator תואם עם כרכים קטנים, sonicate mitochondria 3 פעמים במשך 30 שניות על קרח. צנטריפוגה הדגימה במשך 30 דקות ב 100, 000 x g ב 4 C.ולאסוף את supernatant חדש 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge מצונן מראש. לאחר תיוג הצינור כ- S"עבור שבר חלבון מסיס, שמור את הצינור על הקרח.resuspend הכדור מהשלב הקודם ב 400 l של חוצץ SEM קר כקרח. מעבירים 100 ליטר מהכדור המחודש לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש מצונן מראש ב-1.5 מ"ל. תייג את הצינור כ- SMP"עבור חלקיקי גישושנדריאליים שבר, ולשמור את הצינור על קרח.לדלל את 300 l הנותרים של גלולה resuspended קיפל אחד עם מוכן טרי 200 mM נתרן קרבונט. ותדגירה את הדגימה המדוללת על קרח במשך 30 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה המדגם במשך 30 דקות ב 100, 000 x g ב 4 C.לאסוף את supernatant לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל צונן מראש.סמן את המדגם כ-CS עבור שבר על-טבעי פחמתי, ושמור את הצינור על הקרח. resuspend הכדור מהשלב הקודם ב 400 l של חוצץ SEM קר כקרח. ותנו שם לדגימה כ-CP עבור שבר מוגז מוגז.לזרז את כל הדגימות עם חומצה טריכלורואצטית לריכוז סופי של 10%ולדגירה את הצינורות על קרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה הדגימות במשך 10 דקות ב 12, 000 x g ב 4 C.לאחר הסרת supernatant, resuspend כל גלולה במאגר המדגם. אם מאגר הדגימה הופך לצהוב, הוסף 1 עד 5 ליטר של בסיס 1 M Tris עד שהוא הופך לכחול.הוסף 1 ליטר של 200 mM PMSF לכל הצינורות ולאחסן ב 80 C עד ניתוח נוסף על ידי SDS-PAGE ו כתם מערבי. השבר המיטוכונדריאלי הגולמי טוהר על צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז, וירידה במזהמים תאיים אחרים נצפתה. המיטוכונדריה להמרת המיטופלסטיסט היו במעקב על ידי היעלמותו של חלבון החלל הבין-ממבריצי ציטוכרום b2 בכדור.עם המראה הנקוב בסופר-טבעי. החלבון K תיווך השפלה של חלבון intermembrane Sco1 נצפתה עקב הפרעה ממברנה החיצונית על ידי הלם אוסמוטי. שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית אושרה על ידי ההגנה של ציטוכרום b2 ו- Sco1 מפני השפלת חלבון K בשבר הכדור.באופן דומה, ההגנה על החלבון המסיס במטריצה KGD אישרה את שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית. פרופיל כתם מערבי Prx1 הציע לוקליזציה מיטוכונדריאלית כפולה בחלל ובמטריצה בין-משרדית. המיטוכונדריה היו נתונים sonication ומיצוי קרבונט כדי לחקור את הטופולוגיה של חלבונים ממברנה.שפכיית חלבון הממברנה האינטגרלית נשארה בשברירי הכדור. הקג"ד זוהה בשבר העל-טבעי. גילוי של חלבון KGD בכדור נבע וריאציות פרמטר sonication המשפיעים על היווצרות של SMPs.לאחר טיפול נתרן קרבונט, ה- KGD ושבר SMP היו solubilized ונמצא בשבר supernatant. פרופיל כתם מערבי Prx1 הציע קשר עם פריפריה ממברנה. להצלחת פרוטוקול הפירוק של ההגשה, חשוב להפסיק את פעילות ה-K של פרוטאינאז לאחר נפיחות היפוטונית על ידי הוספת PMSF לדגימות.אתרים מספקים מידע על לוקליזציה של חלבון גישושנדריאלי. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבדוק את השלמות של תכשירים מיטוכונדריאליים, שהוא בסיסי במהלך מחקרים פרוטאומיים של תת-מחשבים מיטוכונדריאליים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

מסך 2-היברידית שמרים אצווה כדי להשוות בין אינטראקציות חלבון

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

ניתוח כמותי של הליפידום הסלולר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית משולב עם טנדם מסה ספקטרומטריה

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

ניתוח של סינתזת שומנים נייטרלית ב cerevisiae Saccharomyces על ידי תיוג מטבולי כרומטוגרפיה שכבה דקה

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...