Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
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サブションドリアルマーカータンパク質Cytに対して抗体を提供してくれたA.ツァゴロフ博士(コロンビア大学)に感謝します。 b2、αKGD、およびスコ1。また、この議定書の確立に際して、マリオ・エンリケ・デ・バロス博士(サンパウロ大学)の有益な議論とコメントに感謝します。
この研究は、プンダサン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ(FAPESP)(助成金2013/07937-8)からの研究助成金によって支えられました。
フェルナンド・ゴメスとヘレナ・トゥラーノもFAPESP、助成金2017/09443-3と2017/23839-7によってサポートされています。アンジェリカ・ラモスは、コルデナサン・デ・アペルフェイソアメント・デ・ペソアル・デ・ニーヴェル・スーペリア(CAPES)の支援も受けます。

1. 酵母細胞の増殖
<ol><li>細胞の小さな部分を-80°CグリセロールストックからYPD(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース)寒天プレートにストリークさせることにより、目的の株の単一コロニーを単一分離する。プレートを30°Cで2~3日間インキュベートします。 注:このプロトコルで使用されるS.セレビシエ株はBY4741(MATα;;彼の3Δ1;leu2Δ0;met15Δ0;<em...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+submitochondrial+protein+distribution.">Landscape of submitochondrial protein distribution.</a> Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+a+high-confidence+mitochondrial+proteome+at+quantitative+scale.">Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale.</a> Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).</li><li>Zahedi, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).</li><li>Gomes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+by+the+inner+membrane+peptidase+(IMP)+complex+or+Oct1+peptidase+controls+the+localization+of+the+yeast+peroxiredoxin+Prx1+to+distinct+mitochondrial+compartments.">Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+Application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Glick, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+c1+and+b2+are+sorted+to+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria+by+a+stop-transfer+mechanism.">Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism.</a> Cell. 69 (5), 809-822 (1992).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

ここに示すプロトコルは、送信コンパートメント13、14、18、21、22、23におけるタンパク質の局在を決定するために、長い間使用され、継続的に最適化されています。このプロトコルの信頼性と再現性は、ミトコンドリア製剤の純度と完全性に強...

ミトコンドリアは、生物エネルギー、細胞代謝、およびシグナル伝達経路において重要な役割を果たす真核細胞の重要なオルガネラである1。これらのタスクを適切に実行するために, ミトコンドリアは、その構造と機能を担当するタンパク質と脂質のユニークなセットに依存しています。.出芽酵母サッカロミセス・セレビシエは、ミトコンドリアプロセスおよび他のオルガネラ2の研究のためのモデルシステムとして広く使用されています。酵母の8つのタンパク質についてのミトコンドリアゲノムコード;ミトコンドリアタンパク質の大部分(99%)は、細胞質リボソームに翻訳された核遺伝子によってコード化され、その後、高度なタンパク質輸入機によって正しいサブコションコンパートメントに輸入されます3,4,5。したがって、ミトコンドリアの生生成は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの両方の協調発現に依存する6,7。ミトコンドリア生検における欠損を引き起こす遺伝子変異は、ヒト疾患8,9,10と関連している。
過去20年間で、高精製ミトコンドリアを標的としたハイスループットプロテオミクス研究は、酵母ミトコンドリアプロテオームの包括的な特性化をもたらし、少なくとも900タンパク質11,12,13,14から構成されると推定されています。これらの研究は貴重な情報を提供したが、4つのミトコンドリアサブコンパートメントにおける各タンパク質のサブオーガネラの局在、すなわち、外膜(OM)、膜間空間(IMS)、内膜(IM)、およびマトリックスが依然として必要である。この質問は、2つの小さなミトコンドリアサブコンパートメント(OMおよびIMS)15,16のプロテオミオミ全体の研究で部分的に対処された。最近では、Vögtleと共同研究者は、酵母におけるサブコションドリアルタンパク質分布の高品質なグローバルマップを生成することで大きな前進を遂げた。著者らは、SILACベースの定量的質量分析、異なるサブコセンドローム分画プロトコル、およびOMおよびIMSプロテオームからのデータセットを組み合わせた統合アプローチを用いて、818タンパク質を4つのミトコンドリアサブコンパートメント13に割り当てた。
これらのハイスループットプロテオーム研究によって達成された進歩にもかかわらず、提出プロテオーム組成に関する我々の知識は決して完全ではないほどです。実際、Vögtleおよび共同研究者によって酵母ミトコンドリアに局在していると報告された986タンパク質のうち、168は4つのサブソキアドリアコンパートメント13のいずれにも割り当てることができなかった。さらに、ミトコンドリア膜の周囲に末梢に付着すると予測されたタンパク質の膜トポロジーに関する情報は提供しなかった。例えば、内膜に末梢に付着したタンパク質がマトリックスや膜間空間に向いているかどうかを知ることはできない。プロテオーム全体の研究からこれらの欠けているデータとは別に、かなりの数のミトコンドリアタンパク質のサブオーガネラの局在に関する矛盾する情報があります。その一例が、サッカロマイセスゲノムデータベース(SGD)やユニプロットなどの一般的なデータベースで膜間空間タンパク質として割り当てられたプロテアーゼPrd1です。驚くべきことに、ここで説明したような亜分解析プロトコルを使用して、Vögtleと共同研究者は、Prd1が本物のマトリックスタンパク質13であることを明確に示した。前述のように、多くのミトコンドリアタンパク質の局所的な局在化を解明または再評価する必要があります。ここでは、酵母ミトコンドリアタンパク質の副オーガンエリアの局在を決定するための、シンプルで信頼性の高いプロトコルを提供します。このプロトコルは、様々な研究グループによって開発され、最適化され、多くのミトコンドリアタンパク質の膜トポロジーと同様に、サブソクオントリアル局在化を決定するために日常的に使用されてきました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

酵母ミトコンドリアプロテオームの特徴付けの最近の進歩にもかかわらず、かなりの数のタンパク質の局所的な局在は依然として不可解である。ここでは、ミトコンドリアタンパク質機能解明の基本的なステップと考えられる酵母ミトコンドリアタンパク質の副組織化機能の局在を決定するための堅牢かつ効果的な方法について述べた。この方法は、非常に純粋な無傷のミトコンドリアを得ることを含む最初のステップを含む。これらのミトコンドリア製剤は、次に、低張性ショック(腫脹)およびプロテナーゼK(プロテアーゼ)によるインキュベーションからなる亜分画プロトコールを受ける。腫脹の間、外のミトコンドリア膜は選択的に破壊され、プロテイナーゼKが膜間空間コンパートメントのタンパク質を消化することを可能にする。並行して、膜タンパク質のトポロジーに関する情報を得るために、ミトコンドリア製剤は、最初に超音波処理され、次いで炭酸ナトリウムによるアルカリ抽出を行う。最後に、遠心分離後、これらの異なる治療からのペレットおよび上清画分は、SDS-PAGEおよびウェスタンブロットによって分析される。局所的局在化と、関心のあるタンパク質の膜トポロジーは、そのウェスタンブロットプロファイルを既知の標準と比較することによって得られる。

提出分画プロトコルの成功は、高度に精製された無傷のミトコンドリアを得るにかかっています。このために、酵母細胞のリシスの間、オルガネラの無傷性はほぼ完全に保存されたままである必要があります。これは、Dounceホモジナイザーを使用して、細胞壁の酵素消化とそれに続く細胞膜の物理的破壊を組み合わせた細胞ライシスプロトコルを使用することによって達成される。ミトコン?...

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Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

最近の進歩にもかかわらず、多くの酵母ミトコンドリアタンパク質は依然としてその機能が全く知られていません。このプロトコルは、タンパク質の分子機能の解明の基礎であったタンパク質の局所的な局在を決定するための、シンプルで信頼性の高い方法を提供します。

出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

このプロトコルは、ミトコンドリアタンパク質機能解明の基本的なステップと考えられている酵母ミトコンドリアタンパク質のサブシリンダライゼーションを決定するように設計されています。プロトコルは異なった成長条件で維持される私達の酵母株のために適している。ミトコンドリア研究として研究のための強力なツールを表します。まず、グリセロールストックから80Cに貯蔵されたストリーク細胞は、YPD寒天プレート上に、目的の株から単一コロニーを単一のコロニーを単離する。30°Cでプレートを2〜3日間インキュベートする。10〜30mlのYPGal培地を含む100mlのエルレンマイヤーフラスコにYPD寒天プレートから2〜3個のコロニーを接種してスターター培養を調製する。フラスコを30°Cで24時間インキュベートし、180~200rpmで激しく揺れます。スターター培養液を新鮮なYPGal培地の1 Lに希釈し、600 nmで0.1未満の光学密度にします。光密度が1〜1.5に達するまで、180〜200rpmで180〜200rpmで激しく揺れ、30°Cで細胞を培養します。テキストに記載されているように、高度に精製されたミトコンドリアの分離を行う。そして、高精製ミトコンドリア製剤のタンパク質濃度を決定し、ブラッドフォードアッセイを使用して、製造業者の指示に従う。氷冷SEMバッファーでタンパク質濃度を10 mg/mlに調整します。高度に精製されたミトコンドリア40 lを4つの1.5 mlの予冷および標識されたマイクロ遠心分離管に移す。第1および第2の管にSEMバッファーの360 lを加える。そして3及び第4の管におけるEM緩衝液の360 lと。ピペット化スキームを用いて、テキストに従って、第2および第4のチューブに4Lの新しく調製したプロテイナーゼKを加える。すべてのチューブを穏やかに混合した後、時折混合して30分間氷の上でインキュベートします。プロテナーゼK活性を停止するには、4つのチューブすべてに4Lの200 mM PMSFを加える。4 C.で30分間チューブを20,000 x g遠心分離し、ペレットを邪魔することなく上清を新しい1.5mlの事前冷蔵ラベル付きマイクロ遠心チューブに集めます。次に、ペレットを氷冷SEMバッファーの400 lに再懸濁する。プロテイナーゼKの可能な痕跡を不活性化するには、収集した上清を沈殿させ、トリクロロ酢酸でペレットを10%氷上のチューブを10分間インキュベートする最終濃度に再懸濁します。トリクロロ酢酸処理サンプルを4Cで12,000 x gで10分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを200lのサンプルバッファーに再懸濁させる。ブロモフェノールブルーが黄色に変わったら、1 Mトリスベースの1〜5 lを加え、青色になるまで追加します。すべてのチューブに200 mM PMSFの4 lを追加します。SDS-PAGEとウェスタンブロットによるさらなる分析まで、サンプルを80°Cで保管してください。高度に精製されたミトコンドリアの200 lを1.5mlの予冷したマイクロ遠心分離管に移す。ミトコンドリアを氷冷SEMバッファーで1倍希釈します。少量と互換性のあるソニケーターを使用して、氷の上で30秒間ミトコンドリアを3回超音波処理します。サンプルを4°Cで30分間遠心し、新しい1.5mlのプレチルドマイクロ遠心分離チューブに上清を集めます。可溶性タンパク質画分のS"としてチューブを標識した後、氷の上にチューブを保持します。前のステップからペレットを氷冷SEMバッファーの400 lに再懸濁します。再懸濁されたペレットの100 lを新しい1.5mlの予冷したマイクロ遠心分離管に移す。サブセクション粒子の分画の場合は、チューブに「SMP」というラベルを付け、チューブを氷の上に置きます。残りの300lの再懸濁ペレットを、作りたての200mM炭酸ナトリウムで1倍に希釈します。希釈したサンプルを氷の上で30分間インキュベートします。次いで、サンプルを4 Cで100,000 x gで30分間遠心分離し、上清を新しい1.5mlのプレチルされたマイクロ遠心分離管に集める。炭酸塩上清分の分率の場合はサンプルを「CS」とラベル付けし、チューブを氷の上に置きます。前のステップからペレットを氷冷SEMバッファーの400 lに再懸濁します。そして、炭酸塩析出画分のCP"としてサンプルに名前を付けます。すべてのサンプルをトリクロロ酢酸で沈殿し、最終濃度の10%にし、氷上のチューブを10分間インキュベートします。次いで、4Cで12,000xgで10分間サンプルを遠心分離し、上清を除去した後、サンプルバッファー内の各ペレットを再懸濁する。サンプルバッファーが黄色になった場合は、1 M トリス ベースの 1 ~ 5 l を青色になるまで追加します。200 mM PMSF の 1 l をすべてのチューブに加え、SDS-PAGE とウェスタンブロットによる分析が行なくなるまで 80°C で保管します。粗ミトコンドリア画分をスクロース密度勾配遠心分離で精製し、他の細胞汚染物質の減少が観察された。ミトコンドリアからミトプラストへの変換は、ペレット中の膜間空間タンパク質シトクロムb2の消失によって監視された。上清に併せる外観で。膜間タンパク質Sco1のタンパク質K媒介分解は、浸透衝撃による外膜破壊のために観察された。外側ミトコンドリア膜の完全性は、ペレット画分におけるプロテナーゼK分解に対するシトクロムb2およびSco1の保護によって確認された。同様に、マトリックス可溶性タンパク質KGDの保護は、内ミトコンドリア膜完全性を確認した。Prx1ウェスタンブロットプロファイルは、膜間空間およびマトリックスにおける二重ミトコンドリア局在化を示唆した。ミトコンドリアは、超音波処理と炭酸塩抽出を行い、膜タンパク質のトポロジーを調査した。含分膜タンパク質はペレット画分に残った。上清画分でKGDが検出された。ペレット中のKGDタンパク質の検出は、SMPの形成に影響を与える超音波処理パラメータの変動によるものである。炭酸ナトリウム処理後、KGDおよびSMP画分を可溶化し、上清画分中に見つかった。Prx1ウェスタンブロットプロファイルは、膜周辺との関連を示唆した。サブセクオンドリア分画プロトコルの成功のためには、PMSFをサンプルに添加することによって低血圧腫脹後のプロテアーゼK活性を停止することが重要である。サイトは、サブソキアドリアルタンパク質の局在に関する情報を提供します。このプロトコルは、ミトコンドリアサブコンパートメントのプロテオーム研究中に基本的であるミトコンドリア製剤の完全性をチェックするためにも使用できます。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

リボソームのプロファイリングによる出芽酵母における翻訳のゲノムの定量化

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

酵母細胞の酸化ストレスに対するタンパク質凝集の影響の評価

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

蛋白質の相互作用を比較するバッチの酵母 2 ハイブリッド スクリーン

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

サッカロミセス・セレビシエ・スプライセソソーム・サブコンプレックスの過渡性インターアクター検出のためのグラフィックスの利用

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

ベーカー酵母サッカロミセス・セレビシエにおけるミトコンドリアゲノム発現産物の表示と可視化

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

代謝標識と薄層クロマトグラフィーによる サッカロミセス・セレビシエ における中性脂質合成の解析

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...