Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
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우리는 제출 에 대한 제기 항체를 제공 에 이 치골로프 박사 (컬럼비아 대학) 박사 에게 감사드립니다 Cyt. b2, αKGD 및 스코1. 우리는 또한 이 프로토콜의 수립 기간 동안 유용한 토론과 의견에 대한 마리오 헨리크 드 바로스 박사 (Universidade 드 상파울루)에게 감사드립니다.
이 작품은 Fundação 드 Amparo à Pesquisa do Estado de 상파울루 (FAPESP) (보조금 2013/07937-8)의 연구 보조금에 의해 지원되었습니다.
페르난도 고메스와 헬레나 투라노도 FAPESP의 지원을 받으며, 2017/09443-3및 2017/23839-7을 각각 지원합니다. 앙겔리카 라모스는 코르데나샤오 데 아페르페이소아멘토 데 페소알 드 니벨 슈페리어(CAPES)의 지원을 받고 있습니다.

1. 효모 세포의 성장
<ol><li>-80°C 글리세롤 스톡으로부터 세포의 작은 부분을 YPD(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 포도당 2% 포도당)에 적신시켜 관심의 단일 콜로니를 분리한다. 플레이트를 30°C에서 2-3일 동안 배양한다. 참고: 이 프로토콜에 사용되는 S. 세레비시아에 균주는 BY4741(MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). 보조 영양 마커 유전?...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importing+mitochondrial+proteins:+machineries+and+mechanisms.">Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms.</a> Cell. 138 (4), 628-644 (2009).</li><li>Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import:+from+proteomics+to+functional+mechanisms.">Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).</li><li>Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).</li><li>Gomes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+by+the+inner+membrane+peptidase+(IMP)+complex+or+Oct1+peptidase+controls+the+localization+of+the+yeast+peroxiredoxin+Prx1+to+distinct+mitochondrial+compartments.">Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+Application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Glick, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+c1+and+b2+are+sorted+to+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria+by+a+stop-transfer+mechanism.">Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism.</a> Cell. 69 (5), 809-822 (1992).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

여기에 제시된 프로토콜은 성공적으로 사용되고 지속적으로 제출된 본래의 단백질 국소화를 결정하기 위해 장기간 에 최적화되어 있다13,14,18,21,22,23. 이 프로토콜의 신뢰성과 재현성은 미토콘드리아 제제의 순도와 무결성에 크게 의존한다<sup class=...

미토콘드리아는 생체 에너지, 세포 대사 및 신호 경로1에서 중요한 역할을 하는 진핵 세포의 필수 세포입니다. 이러한 작업을 제대로 실행하기 위해 미토콘드리아는 구조와 기능을 담당하는 독특한 단백질과 지질 세트에 의존합니다. 신진 효모 사카로미세스 cerevisiae 널리 미토콘드리아 프로세스에 대한 조사를위한 모델 시스템으로 사용되었습니다, 뿐만 아니라 다른 세포기관2. 효모에 있는 단지 8개의 단백질을 위한 미토콘드리아 게놈 코드; 미토콘드리아 단백질의 대다수 (~99%)는 세포성 리보솜에서 번역되는 핵 유전자에 의해 인코딩되고, 그 후에 정교한 단백질 수입 기계에 의해 그들의 정확한 제출된 제출으로 수입됩니다3,4,5. 따라서, 미토콘드리아 생물발생은 핵과 미토콘드리아 게놈 6,7의 조정된 발현에 의존한다6,7. 미토콘드리아 생물 발생에 결함을 일으키는 유전 돌연변이는 인간 질병8,9,10과 연관됩니다.
지난 2년간 고정화 미토콘드리아를 대상으로 한 고처리량 프로테오믹 연구는 효모 미토콘드리아 프로테오메의 포괄적인 특성화를 초래했으며, 이는 적어도 900단백질11,12,13,14로 구성된 것으로 추정되고 있다. 이러한 연구는 귀중한 정보를 제공했지만, 4개의 미토콘드리아 하위 구획, 즉 외부 막(OM), 막 간 공간(IMS), 내부 막(IM) 및 매트릭스에서 각 단백질의 소구체화가 여전히 요구된다. 이 질문은 부분적으로 두 개의 작은 미토콘드리아 하위 구획의 프로테오믹 전체 연구로 해결되었다 (OM 및 IMS)15,16. 최근에는 Vögtle과 협력자들은 효모에서 고품질의 글로벌 프로포톤드 단백질 분포지도를 생성하여 큰 진전을 이루었습니다. 저자는 SILAC 기반 정량 질량 분광법, 상이한 제출 분별 프로토콜 및 OM 및 IMS 프로테옴의 데이터 세트를 결합한 통합 된 접근 방식을 사용하여 818 단백질을 4 개의 미토콘드리아 하위 구획13에 할당했습니다.
이러한 높은 처리량 프로테오믹 연구에 의해 달성 된 진보에도 불구하고, 제출 프로테오메 조성에 대한 우리의 지식은 완료되지 않습니다. 실제로, Vögtle및 협력자가 효모 미토콘드리아로 국소화되는 것으로 보고된 986개의 단백질 중, 168개는 4개의 제출된 제출된 구획13에서 할당될 수 없었습니다. 더욱이, 저자는 미토콘드리아 막의 주변에 말초로 부착될 것으로 예상되었던 단백질의 막 토폴로지에 관하여 정보를 제공하지 않았다. 예를 들어, 내막에 말초로 부착된 단백질이 매트릭스 또는 막 간 공간을 향하고 있는지 알 수 없다. 프로테오메 전체 연구에서 이러한 누락 된 데이터 외에도, 미토콘드리아 단백질의 상당수의 suborganellar 국소화에 대 한 충돌 하는 정보가 있다. 한 가지 예는 Saccharomyces 게놈 데이터베이스 (SGD) 및 Uniprot와 같은 일반적인 데이터베이스에 있는 막 간 공간 단백질로 할당된 protease Prd1입니다. 놀랍게도, 여기에 설명된 것과 유사한 과절 프로토콜을 사용하여 Vögtle 및 협력자들은 Prd1이 정품 매트릭스 protein13임을 분명히 보여주었습니다. 위에서 언급했듯이, 많은 미토콘드리아 단백질의 제출국국화는 해명되거나 재평가될 필요가 있다. 여기서, 우리는 효모 미토콘드리아 단백질의 소독제 국소화를 결정하기 위하여 간단하고 신뢰할 수 있는 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 다양한 연구 그룹에 의해 개발되고 최적화되었으며 많은 미토콘드리아 단백질의 막 토폴로지뿐만 아니라 제출국소화를 결정하는 데 일상적으로 사용되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

효모 미토콘드리아 프로테오메의 특성화에 있는 최근 어드밴스에 있는 진보에도 불구하고, 단백질의 상당수의 제출국국화는 애매하게 남아 있습니다. 여기서, 우리는 미토콘드리아 단백질 기능 용해화 동안 근본적인 단계로 간주되는 효모 미토콘드리아 단백질의 소구체국화를 결정하는 강력하고 효과적인 방법을 설명합니다. 이 방법은 고도로 순수한 그대로미토콘드리아를 얻는 것으로 구성된 초기 단계를 포함한다. 이러한 미토콘드리아 제제는 단백질제 K(protease)를 사용하여 저혈압(swelling) 및 배양으로 구성된 서브배율 프로토콜을 받게 된다. 붓기 동안, 외부 미토콘드리아 막은 선택적으로 중단되어 단백질Ae K가 막 간 공간 구획의 단백질을 소화할 수 있게 합니다. 병행하여 막 단백질의 토폴로지에 대한 정보를 얻기 위해 미토콘드리아 제제는 처음에는 초음파 처리된 다음 탄산나트륨을 사용하여 알칼리성 추출을 실시한다. 마지막으로, 원심 분리 후, 이러한 다른 치료법에서 펠릿과 상피 분획은 SDS-PAGE 및 서부 블롯에 의해 분석됩니다. 관심 있는 단백질의 막 토폴로지뿐만 아니라 제출된 국소화는 서양 블롯 프로파일을 알려진 표준과 비교하여 얻어진다.

제출의 성공은 고도로 정제된 미토콘드리아를 얻는 것에 달려 있습니다. 이를 위해 효모 세포 용해 중에 세포세포의 손상성이 거의 완전히 보존되어 있는 것이 필수적입니다. 이는 세포벽의 효소 소화를 결합한 세포 용해 프로토콜을 이용하여 두스호균제를 사용하여 플라즈마 멤브레인의 물리적 중단을 통해 달성된다. 미토콘드리아 내용은 차동 원심분리에 의해 수집됩니다. 이러한 세포전 분획...

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Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

이 프로토콜은 미토콘드리아 단백질 기능 용해화 중 근본적인 단계로 간주되는 효모 미토콘드리아 단백질의 제출된 국소화를 결정하도록 설계되었습니다. 프로토콜은 다른 성장 조건에서 유지되는 효모 균주에 적합합니다. 미토콘드리아를 연구하는 것으로 연구를 위한 강력한 도구를 대표합니다.우선, 80C에 저장된 글리세롤 스톡의 줄무늬 세포가 YPD 한천 판에 들어가서 단일 콜로니를 관심있는 변형으로부터 분리합니다. 그리고 2 ~ 3 일 동안 30 C에서 플레이트를 배양하십시오. YPGal 배지 10~30ml를 함유한 100ml 에렌마이어 플라스크에서 YPD 사마접시에서 2~3개의 개별 콜로니를 접종하여 스타터 컬쳐를 준비합니다.플라스크를 30C에서 24시간 동안 인큐베이팅하여 180~200rpm에서 격렬한 흔들림을 합니다. 스타터 배양을 신선한 YPGal 배지 의 1L로 희석하여 600 nm에서 0.1 미만의 광학 밀도로 희석합니다. 광학 밀도가 1 에서 1.5에 도달할 때까지 약 180 에서 200 rpm에서 약 12 시간 동안 활발한 흔들림으로 30 C에서 세포를 재배하십시오.텍스트에 설명된 바와 같이 고도로 정제된 미토콘드리아의 분리를 수행한다. 그리고 제조 업체의 지시에 따라 브래드포드 분석기를 사용하여 고도로 정제 된 미토콘드리아 제제의 단백질 농도를 결정합니다. 얼음 차가운 SEM 버퍼로 단백질 농도를 10 mg/ml로 조정합니다.고도로 정제된 미토콘드리아 40l을 1.5ml의 사전 냉장 및 표지된 미세원심분리기 튜브 4개로 옮춥니다. 첫 번째 및 두 번째 튜브에 360 l의 SEM 버퍼를 추가합니다. 그리고 제 3 및 네 번째 튜브에서 EM 버퍼의 360 l.텍스트에 따라 파이펫팅 방식을 사용하여 두 번째 및 네 번째 튜브에 갓 준비된 단백질 Ase K 4 L을 추가합니다. 모든 튜브를 부드럽게 혼합한 후, 가끔 섞어 30분 동안 얼음에 배양합니다. 단백질Ae K 활성을 중지하려면 4개의 튜브모두에 200mM PMSF의 4L을 추가합니다.4C.에서 30 분 동안 20, 000 x g의 튜브를 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않고 새로운 1.5 ml 미리 차가운 라벨 마이크로 센시드 퍼지 튜브로 슈퍼 네티컬을 수집합니다. 다음으로, 얼음 차가운 SEM 버퍼 400l에서 펠릿을 다시 놓습니다. 단백질제 K의 가능한 흔적을 비활성화하려면 수집된 수퍼나탈을 침전시키고 트리클로로아세트산으로 펠릿을 10%의 최종 농도로 10분간 얼음에 튜브를 배양한다.원심분리제 는 4C.에서 12, 000 x g에서 10 분 동안 처리 된 트리클로로아세트산 샘플을 원심 분리하고 상퍼를 제거 한 후 200 l의 샘플 버퍼에서 펠릿을 다시 중단합니다. 브로모페놀 블루가 노란색으로 변하면 1M Tris 베이스의 1~5l을 추가하여 파란색으로 바뀝니다. 모든 튜브에 200mM PMSF 4l을 추가합니다.SDS PAGE 및 서부 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 샘플을 80C로 저장합니다. 고도로 정제된 미토콘드리아 200l을 1.5ml의 미리 차가운 미세 원심분리기 튜브로 옮춥니다. 미토콘드리아를 얼음으로 차가운 SEM 버퍼로 1배 희석합니다.소량과 호환되는 초음파 처리기를 사용하여 미토콘드리아를 얼음에서 30초 동안 3번 초음파 처리합니다. 원심분리기 는 4C.에서 100, 000 x g에서 30 분 동안 샘플을 원심 분리하고 새로운 1.5 ml 미리 냉각 된 미세 센심 분리기 튜브에서 상체를 수집합니다. 튜브를 용해성 단백질 분획에 대한 S"로 표시한 후 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.얼음 차가운 SEM 버퍼400 l에서 이전 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다. 재중단 된 펠릿 100 l을 새로운 1.5 ml 미리 냉각 된 미세 원심 분리 튜브로 옮춥니다. 튜브를 SMP로 라벨을 부착하여 입자 분획을 제출하고 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.나머지 300l의 재질펠릿을 1배, 갓 준비한 200mMM 나트륨 탄산나트륨으로 희석시키십시오. 그리고 30 분 동안 얼음에 희석 된 샘플을 배양. 그런 다음, 원심 분리는 4C.에서 100, 000 x g에서 30 분 동안 샘플을 새로운 1.5 ml 미리 냉각 된 미세 원심 분리기 튜브로 수집합니다.탄산염 상수 분획에 대한 CS"로 샘플을 라벨, 얼음에 튜브를 유지. 얼음 차가운 SEM 버퍼400 l에서 이전 단계에서 펠릿을 다시 중단합니다. 그리고 탄산염 침전 분획에 대한 CP"로 샘플을 이름.삼중염산으로 모든 샘플을 10%의 최종 농도로 침전시키고 10분 동안 얼음에 튜브를 배양합니다. 이어서, 4C.에서 12, 000 x g에서 10분 동안 샘플을 원심분리한 후, 샘플 버퍼의 각 펠릿을 재연한다. 샘플 버퍼가 노란색이 되면 파란색으로 바뀔 때까지 1~5l의 M Tris 베이스를 추가합니다.SDS-PAGE와 웨스턴 블롯에 의해 추가 분석될 때까지 모든 튜브에 200mM PMSF 1l을 추가하고 80C에 저장합니다. 조미토콘드리아 분획은 자당 밀도 그라데이션 원심분리에 정제되었고, 다른 세포 오염물질의 감소가 관찰되었다. 미토콘드리아는 골레에서 막간 공간 단백질 사이토크롬 b2의 실종에 의해 미토콘드리아를 모니터링하였다.상수에 수반되는 모습. 상기 단백질Ae K는 막 간 단백질 Sco1의 분해를 삼투성 쇼크에 의한 외부 막 중단으로 인해 관찰하였다. 외부 미토콘드리아 멤브레인 무결성은 펠릿 분획에서 단백질Ae K 분해에 대한 시토크롬 b2 및 스코1의 보호에 의해 확인되었다.유사하게, 매트릭스 수용성 단백질 KGD의 보호는 내부 미토콘드리아 막 무결성을 확인하였다. Prx1 웨스턴 블롯 프로파일은 막 간 공간과 매트릭스에서 이중 미토콘드리아 국소화를 제안했습니다. 미토콘드리아는 막 단백질의 토폴로지를 조사하기 위해 초음파 처리 및 탄산염 추출을 실시하였다.부어 지는 일체형 멤브레인 단백질은 펠릿 분획에 남아 있었다. KGD는 상류분획에서 검출되었다. 펠릿에서 KGD 단백질의 검출은 중소기업의 형성에 영향을 미치는 초음파 처리 파라미터 변이 때문이었다.탄산나트륨 처리 후, KGD및 SMP 분획은 용해화되어 상류분획에서 발견되었다. Prx1 웨스턴 블롯 프로파일은 막 주변과의 연관성을 제안했습니다. 제출된 분별 프로토콜의 성공을 위해, 샘플에 PMSF를 추가하여 저근증 부종 후 단백질활성을 중지하는 것이 중요하다.사이트는 제출 단백질 현지화에 대한 정보를 제공합니다. 이 프로토콜은 또한 미토콘드리아 서브구획의 proteomic 연구 도중 근본적인 미토콘드리아 준비의 무결성을 확인하는 것을 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

리보솜을 프로 파일링 하 여 신진 효 모에 번역의 게놈 넓은 정량화

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

연구

생화학

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

효 모 세포 산화 스트레스에 단백질 집단의 영향 평가

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

단백질 상호 작용을 비교 하는 배치에 효 모 2 잡종 스크린

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

사카로미세스 세레비시아스 스플리케소터 서브콤플렉스의 과도성 행위자 검출을 위한 그라픽스의 활용

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

베이커효모사카로미세스 세레비시아에 미토콘드리아 게놈 발현 제품의 라벨링 및 시각화

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Isolation of Mitochondrial Contact Sites

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Unveiling Mitochondrial Contact Sites and Architectural Insights (Video) | JoVE

미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...