Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Vi takker Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) for å ha gitt antistoffer reist mot submitochondrial markørproteiner Cyt. b2, αKGD og Sco1. Vi takker også Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) for nyttig diskusjon og kommentarer under etableringen av denne protokollen.
Dette arbeidet ble støttet av forskningsstipend fra Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (tilskudd 2013/07937-8).
Fernando Gomes og Helena Turano støttes også av FAPESP, tilskudd 2017/09443-3 og 2017/23839-7. Angélica Ramos støttes også av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

1. Vekst av gjærceller
<ol><li>Isoler enkeltkolonier av interessestammen ved å strekke en liten del av cellene fra en -80 °C glyserolbestand på en YPD (1% gjærekstrakt, 2% peptone, 2% glukose) agarplate. Inkuber platen ved 30 °C i 2-3 dager. MERK: S. cerevisiae-stammen som brukes i denne protokollen er avledet fra BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; møtte15Δ0; ura3Δ0). Med unntak av auxotrofiske markørgener inneholder de...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importing+mitochondrial+proteins:+machineries+and+mechanisms.">Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms.</a> Cell. 138 (4), 628-644 (2009).</li><li>Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import:+from+proteomics+to+functional+mechanisms.">Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).</li><li>Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+proteome+and+human+disease.">The mitochondrial proteome and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).</li><li>Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+yeast+mitochondrial+proteome:+Multidimensional+separation+techniques+for+mitochondrial+proteomics.">Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).</li><li>Sickmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteome+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria.">The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).</li><li>V&#246;gtle, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+submitochondrial+protein+distribution.">Landscape of submitochondrial protein distribution.</a> Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+a+high-confidence+mitochondrial+proteome+at+quantitative+scale.">Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale.</a> Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).</li><li>Zahedi, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).</li><li>Gomes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+by+the+inner+membrane+peptidase+(IMP)+complex+or+Oct1+peptidase+controls+the+localization+of+the+yeast+peroxiredoxin+Prx1+to+distinct+mitochondrial+compartments.">Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+Application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Glick, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+c1+and+b2+are+sorted+to+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria+by+a+stop-transfer+mechanism.">Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism.</a> Cell. 69 (5), 809-822 (1992).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

Protokollen som presenteres her har blitt vellykket brukt og kontinuerlig optimalisert i lang tid for å bestemme proteinlokaliseringen i submitochondrial-rommene13,14,18,21,22,23. Påliteligheten og reproduserbarheten til denne protokollen er sterkt avhengig av renheten og integriteten til mitokondriepreparater18.<sup class=...

Mitokondrier er essensielle organeller av eukaryote celler som spiller avgjørende roller i bioenergi, cellulær metabolisme og signalveier1. For å utføre disse oppgavene riktig, er mitokondrier avhengige av et unikt sett med proteiner og lipider som er ansvarlige for deres struktur og funksjon. Den spirende gjæren Saccharomyces cerevisiae har blitt mye brukt som et modellsystem for undersøkelser av mitokondrieprosesser, så vel som for andre organeller2. Mitokondriegenomkodene for bare åtte proteiner i gjær; De aller fleste mitokondrieproteiner (~ 99%) er kodet av kjernegener, som oversettes på cytosoliske ribosomer, og deretter importeres til deres riktige submitochondrialrom av sofistikerte proteinimportmaskiner3,4,5. Dermed avhenger mitokondriebiogenese av det koordinerte uttrykket av både nukleære og mitokondriegenomer6,7. Genetiske mutasjoner som forårsaker defekter i mitokondriebiogenese er forbundet med menneskelige sykdommer8,9,10.
I løpet av de siste to tiårene har proteomiske studier med høy gjennomstrømning rettet mot svært rensede mitokondrier resultert i en omfattende karakterisering av gjær mitokondrieproteom, som har blitt anslått å bestå av minst 900 proteiner11,12,13,14. Selv om disse studiene ga verdifull informasjon, er det fortsatt nødvendig med suborganellar lokalisering av hvert protein i de fire mitokondrieunderkomponentene, nemlig den ytre membranen (OM), intermembrane plass (IMS), indre membran (IM) og matrise. Dette spørsmålet ble delvis tatt opp med proteomiske studier av de to mindre mitokondrie-subcompartments (OM og IMS)15,16. Mer nylig gjorde Vögtle og samarbeidspartnere et stort skritt fremover ved å generere et globalt kart av høy kvalitet over submitochondrial proteinfordeling i gjær. Ved hjelp av en integrert tilnærming som kombinerer SILAC-basert kvantitativ massespektrometri, forskjellige submitochondrial fraksjoneringsprotokoller og datasettet fra OM- og IMS-proteomene, tildelte forfatterne 818 proteiner i de fire mitokondrie-subcompartments13.
Til tross for fremskrittene som oppnås av disse proteomiske studiene med høy gjennomstrømning, er vår kunnskap om den innsendingsorienterte proteomsammensetningen langt fra komplett. Faktisk, blant 986 proteiner rapportert av Vögtle og samarbeidspartnere som lokalisert til gjær mitokondrier, kunne 168 ikke tildeles i noen av de fire submitochondrialrom13. Videre ga forfatterne ikke informasjon om membrantopologien til proteiner som ble spådd å være perifert festet til perifert perifert av mitokondriemembraner. For eksempel er det ikke mulig å vite om et protein som ble tildelt som perifert festet til den indre membranen, vender mot matrisen eller intermembranerommet. Bortsett fra disse manglende dataene fra de proteome-brede studiene, er det motstridende informasjon om suborganellar lokalisering av et betydelig antall mitokondrieproteiner. Et eksempel er protease Prd1, som har blitt tildelt som et intermembrane romprotein i de vanlige databasene som Saccharomyces Genome Database (SGD) og Uniprot. Overraskende nok viste Vögtle og samarbeidspartnere tydelig at Prd1 er et ekte matriseprotein13 ved hjelp av en subfraksjonsprotokoll som ligner den som er beskrevet her. Som nevnt ovenfor må submitochondrial lokalisering av mange mitokondrieproteiner belyses eller revurderes. Her tilbyr vi en enkel og pålitelig protokoll for å bestemme suborganellar lokalisering av gjær mitokondrieproteiner. Denne protokollen ble utviklet og optimalisert av ulike forskningsgrupper og har rutinemessig blitt brukt til å bestemme submitochondrial lokalisering, samt membrantopologien til mange mitokondrieproteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

Til tross for nylige fremskritt i karakteriseringen av gjær mitokondrieproteom, forblir den submitochondriale lokaliseringen av et betydelig antall proteiner unnvikende. Her beskriver vi en robust og effektiv metode for å bestemme suborganellar lokalisering av gjær mitokondrieproteiner, som regnes som et grunnleggende skritt under mitokondrieproteinfunksjonsbelystelse. Denne metoden innebærer et innledende trinn som består av å skaffe seg svært rene intakte mitokondrier. Disse mitokondriepreparatene blir deretter utsatt for en subfraksjonsprotokoll som består av hypotonisk sjokk (hevelse) og inkubasjon med proteinase K (protease). Under hevelse blir den ytre mitokondriemembranen selektivt forstyrret, slik at proteinase K kan fordøye proteiner i det intermembrane romrommet. Parallelt, for å få informasjon om topologien til membranproteiner, blir mitokondriepreparatene i utgangspunktet sonikert, og deretter utsatt for alkalisk ekstraksjon med natriumkarbonat. Til slutt, etter sentrifugering, analyseres pellets og supernatante fraksjoner fra disse forskjellige behandlingene av SDS-PAGE og vestlig blot. Submitochondrial lokalisering samt membrantopologien til proteinet av interesse oppnås ved å sammenligne sin vestlige blotprofil med kjente standarder.

Suksessen til submitochondrial fraksjoneringsprotokoll avhenger av å skaffe svært rensede intakte mitokondrier. For dette er det viktig at organellenes intakthet under gjærcellelysene forblir nesten helt bevart. Dette oppnås ved å bruke en cellelysprotokoll som kombinerer den enzymatiske fordøyelsen av celleveggen etterfulgt av fysisk forstyrrelse av plasmamembranen ved hjelp av en Dounce homogenisator. Mitokondrieinnholdet samles deretter inn ved differensial sentrifugering. Denne subcellulære fraksjoneringen gir...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Til tross for nylige fremskritt forblir mange gjær mitokondrieproteiner fortsatt med sine funksjoner helt ukjente. Denne protokollen gir en enkel og pålitelig metode for å bestemme sendokondrie lokalisering av proteiner, som har vært grunnleggende for belysning av deres molekylære funksjoner.

Vurdering av lokalisering av submitochondrialprotein i spirende gjær saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Denne protokollen er designet for å bestemme den submitochondriale lokaliseringen av gjær mitokondrieproteiner, som regnes som et grunnleggende skritt under mitokondrieproteinfunksjonsucidasjon. Protokollen er egnet for våre gjærstammer opprettholdt under forskjellige vekstforhold. Representerer et kraftig verktøy for forskning som studere mitokondrier.Til å begynne med, strekke celler fra glyserol lager lagret ved 80 C, på en YPD agar plate for å isolere enkeltkolonier fra stammen av interesse. Og inkuber platen ved 30 C i 2 til 3 dager. Forbered en startkultur ved å inokulere 2 til 3 individuelle kolonier fra YPD agar plate i en 100 ml Erlenmeyer kolbe som inneholder 10 til 30 ml YPGal medium.Inkuber kolben ved 30 C i 24 timer med kraftig risting ved 180 til 200 rpm. Fortynn startkulturen i 1 L friskt YPGal-medium til en optisk tetthet mindre enn 0,1 ved 600 nm. Dyrk cellene ved 30 C med kraftig risting ved 180 til 200 rpm i ca 12 timer, til optisk tetthet når 1 til 1,5.Utfør isolasjonen av svært rensede mitokondrier som beskrevet i teksten. Og bestem proteinkonsentrasjonen av det svært rensede mitokondriepreparatet, ved hjelp av Bradford-analysen, etter produsentens instruksjoner. Juster proteinkonsentrasjonen til 10 mg/ml med iskald SEM-buffer.Overfør 40 l svært rensede mitokondrier til fire 1,5 ml forhåndskjølte og merkede mikrocentrifugerør. Tilsett 360 l SEM-buffer i første og andre rør. Og 360 l EM-buffer i tredje og fjerde rør.Ved hjelp av pipetteringsskjemaet, i henhold til teksten, tilsett 4 L nylaget proteinase K i andre og fjerde rør. Etter å ha blandet alle rørene forsiktig, inkuber på is i 30 minutter med sporadisk blanding. For å stoppe proteinase K aktivitet legge 4 L av 200 mM PMSF til alle fire rør.Sentrifuger rørene ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 C.Og samle supernatanten, uten å forstyrre pelletsen, i et nytt 1,5 ml forhåndskjølt merket mikrocentrifugerør. Deretter resuspenderer du pelletsen i 400 liter iskald SEM-buffer. For å inaktivere de mulige sporene av proteinase K, utfell den oppsamlede supernatanten og resuspender pellet med trikloreddiksyre til en endelig konsentrasjon på 10%Inkuber rørene på is i 10 minutter.Sentrifuger de trichloroacetic syrebehandlede prøvene i 10 minutter ved 12.000 x g ved 4 C.Og etter å ha fjernet supernatanten, resuspend pellet i 200 l prøvebuffer. Hvis bromofenolblå blir gul, tilsett 1 til 5 l 1 M Tris base, til den blir blå. Tilsett 4 l 200 mM PMSF til alle rørene.Oppbevar prøvene ved 80 C inntil videre analyse av SDS-PAGE og western blot. Overfør 200 liter svært renset mitokondrier til et 1,5 ml forkjølt mikrocentrifugerør. Fortynn mitokondrier enfoldig med iskald SEM-buffer.Ved hjelp av en soniker som er kompatibel med små volumer, sonikerer mitokondrier 3 ganger i 30 sekunder på is. Sentrifuger prøven i 30 minutter ved 100 000 x g ved 4 C.Og samle supernatanten i et nytt 1,5 ml forkjølt mikrosenterrør. Etter å ha merket røret som S"for løselig proteinfraksjon, hold røret på is.Resuspend pellet fra forrige trinn i 400 l iskald SEM buffer. Overfør 100 l av den resuspenderte pellet til et nytt 1,5 ml forkjølt mikrosenterrør. Merk røret som SMP"for sendokondriepartikler brøkdel, og hold røret på is.Fortynn de resterende 300 liter resuspendert pellet enfold med nytilberedt 200 mM natriumkarbonat. Og inkuber den fortynnede prøven på is i 30 minutter. Deretter sentrifugerer du prøven i 30 minutter ved 100 000 x g ved 4 C.Collect supernatanten i et nytt 1,5 ml forkjølt mikrosenterrør.Merk prøven som CS"for karbonat supernatant brøkdel, og hold røret på is. Resuspend pellet fra forrige trinn i 400 l iskald SEM buffer. Og navngi prøven som CP"for karbonat utfelt brøkdel.Utfell alle prøvene med trikloredsyre til en endelig konsentrasjon på 10%og inkuber rørene på is i 10 minutter. Deretter sentrifugerer du prøvene i 10 minutter ved 12 000 x g ved 4 C.Etter at du har fjernet supernatanten, bruker du hver pellets på nytt i prøvebufferen. Hvis prøvebufferen blir gul, legger du til 1 til 5 l 1 M Tris-base til den blir blå.Tilsett 1 l 200 mM PMSF i alle rørene og lagre ved 80 C inntil videre analyse av SDS-PAGE og western blot. Den rå mitokondriefraksjonen ble renset på sukrosetetthet gradient sentrifugering, og reduksjon i andre cellulære forurensninger ble observert. Mitokondrier til mitokriske konvertering ble overvåket av forsvinningen av intermembrane romprotein cytokrom b2 i pellets.Med det samtidige utseendet i supernatanten. Proteinase K mediert nedbrytning av intermembrane protein Sco1 ble observert på grunn av ytre membranforstyrrelser ved osmotisk sjokk. Den ytre mitokondriemembranintegriteten ble bekreftet ved beskyttelse av cytokrom b2 og Sco1 mot proteinase K nedbrytning i pelletsfraksjonen.På samme måte bekreftet beskyttelsen av matriseløselig protein KGD den indre mitokondriemembranintegriteten. Prx1 western blot profil foreslo dobbel mitokondrie lokalisering i intermembrane plass og matrise. Mitokondrier ble utsatt for sonikering og karbonatutvinning for å undersøke topologien til membranproteiner.Det integrerte membranproteinet som helles forble i pelletsfraksjonene. KGD ble oppdaget i den supernatante fraksjonen. Påvisning av KGD-protein i pellet skyldtes sonikeringsparametervariasjoner som påvirker dannelsen av SMB-er.Etter natriumkarbonatbehandling ble KGD og SMP-fraksjonen solubilisert og funnet i den supernatante fraksjonen. Prx1 vestlig blot profil foreslo en tilknytning til membran periferi. For suksessen til den sendende fraksjoneringsprotokollen er det viktig å stoppe proteinase K-aktivitet etter hypotonisk hevelse ved å legge PMSF til prøvene.Nettsteder gir informasjon om lokalisering av submitochondrialprotein. Denne protokollen kan også brukes til å sjekke integriteten til mitokondriepreparater, noe som er grunnleggende under proteomiske studier av mitokondrie subcompartments.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genomet hele kvantifisering av oversettelse i spirende gjær av ribosom profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Evaluering av virkningen av Protein Oppsamling på mobilnettet oksidativt Stress i gjær

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

En gjær 2-Hybrid skjerm i Batch sammenligne Protein interaksjoner

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analyse av cellulær lipidom eav saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandem massespektrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utnyttelse av Grafix for påvisning av forbigående interagere av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Merking og visualisering av mitokondriegenomuttrykksprodukter i Baker&apos;s Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomikk av saccharomyces cerevisiae ved hjelp av flytende kromatografi kombinert med tandemmassespektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analyse av nøytral lipidsyntese i saccharomyces cerevisiae ved metabolsk merking og tynn lagkromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Forberedelse og Cryo-FIB mikromaskinering av Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...