Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
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Agradecemos ao Dr. A. Tzagoloff (Universidade de Columbia) por fornecer anticorpos levantados contra proteínas marcadores subocondriais Cyt. b2, αKGD e Sco1. Agradecemos também ao Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) pela discussão e comentários úteis durante a criação deste protocolo.
Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (bolsa 2013/07937-8).
Fernando Gomes e Helena Turano também são apoiados pela FAPESP, bolsas 2017/09443-3 e 2017/23839-7, respectivamente. Angélica Ramos também conta com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

1. Crescimento de células de levedura
<ol><li>Isole colônias únicas da tensão de interesse, espalhando uma pequena porção das células de um estoque de glicerol de -80 °C em um YPD (extrato de levedura de 1%, 2% peptone, 2% glicose) placa de ágar. Incubar a placa a 30 °C durante 2-3 dias. NOTA: A cepa S. cerevisiae utilizada neste protocolo é derivada de BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Com exceç?...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+submitochondrial+protein+distribution.">Landscape of submitochondrial protein distribution.</a> Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+a+high-confidence+mitochondrial+proteome+at+quantitative+scale.">Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale.</a> Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).</li><li>Zahedi, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. 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I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

O protocolo aqui apresentado tem sido utilizado com sucesso e continuamente otimizado por um longo tempo para determinar a localização da proteína nos compartimentos subocondriais13,14,18,21,22,23. A confiabilidade e a reprodutibilidade deste protocolo dependem fortemente da pureza e integridade das preparações mitocondr...

Mitocôndrias são organelas essenciais de células eucarióticas que desempenham papéis cruciais em bioenergésicos, metabolismo celular e caminhos de sinalização1. Para executar adequadamente essas tarefas, as mitocôndrias contam com um conjunto único de proteínas e lipídios responsáveis por sua estrutura e função. O fermento saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizado como um sistema modelo para investigações sobre processos mitocondriais, bem como para outras organelas2. Os códigos do genoma mitocondrial para apenas oito proteínas na levedura; a grande maioria das proteínas mitocondriais (~99%) são codificadas por genes nucleares, que são traduzidas em ribossomos citosóicos, e posteriormente importadas em seus compartimentos submitocondriais corretos por máquinas sofisticadas de importação de proteínas3,4,5. Assim, a biogênese mitocondrial depende da expressão coordenada dos genomas nucleares e mitocondriais6,7. Mutações genéticas que causam defeitos na biogênese mitocondrial estão associadas a doenças humanas8,9,10.
Nas últimas duas décadas, estudos proteômicos de alto rendimento direcionados a mitocôndrias altamente purificadas resultaram em uma caracterização abrangente do proteome mitocondrial de levedura, que foi estimado em pelo menos 900 proteínas11,12,13,14. Embora esses estudos tenham fornecido informações valiosas, a localização suborganellar de cada proteína nos quatro subcomentários mitocondriais, ou seja, a membrana externa (OM), o espaço intermembrano (IMS), a membrana interna (IM) e a matriz, ainda são necessários. Esta questão foi parcialmente abordada com estudos proteômicos dos dois subcoentamentos mitocondriais menores (OM e IMS)15,16. Mais recentemente, Vögtle e colaboradores fizeram um grande passo à frente, gerando um mapa global de alta qualidade de distribuição de proteínas subocondriais na levedura. Usando uma abordagem integrada que combina espectrometria quantitativa de massa baseada em SILAC, diferentes protocolos de fracionamento submitocondrial e o conjunto de dados dos proteomes OM e IMS, os autores atribuíram 818 proteínas nos quatro subcoentamentos mitocondriais13.
Apesar dos avanços alcançados por esses estudos proteômicos de alto rendimento, nosso conhecimento sobre a composição de proteome subocondrial está longe de ser completo. De fato, entre 986 proteínas relatadas por Vögtle e colaboradores como sendo localizadas em mitocôndrias de levedura, 168 não poderiam ser atribuídas em nenhum dos quatro compartimentos subocondriais13. Além disso, os autores não forneceram informações sobre a topologia da membrana das proteínas que se previu estar periféricamente ligada à periferia das membranas mitocondriais. Por exemplo, não é possível saber se uma proteína que foi atribuída como periféricamente ligada à membrana interna está voltada para a matriz ou o espaço intermembrano. Além desses dados perdidos dos estudos proteome-em toda, há informações conflitantes sobre a localização suborganellar de um número significativo de proteínas mitocondriais. Um exemplo é o prd1 protease, que foi atribuído como uma proteína espacial intermembrana nos bancos de dados comuns, como o Saccharomyces Genome Database (SGD) e o Uniprot. Surpreendentemente, usando um protocolo de subfração semelhante ao descrito aqui, Vögtle e colaboradores mostraram claramente que Prd1 é uma verdadeira proteína matricial13. Como mencionado acima, a localização subocondrial de muitas proteínas mitocondriais precisa ser elucidada ou reavaliada. Aqui, fornecemos um protocolo simples e confiável para determinar a localização suborganellar de proteínas mitocondriais de leveduras. Este protocolo foi desenvolvido e otimizado por diversos grupos de pesquisa e tem sido rotineiramente utilizado para determinar a localização subocondrial, bem como a topologia da membrana de muitas proteínas mitocondriais.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

Apesar dos recentes avanços na caracterização do proteome mitocondrial da levedura, a localização subocondrial de um número significativo de proteínas permanece indescritível. Aqui, descrevemos um método robusto e eficaz para determinar a localização suborganellar das proteínas mitocondriais de levedura, que é considerada um passo fundamental durante a elucidação da função proteica mitocondrial. Este método envolve uma etapa inicial que consiste em obter mitocôndrias intactas altamente puras. Essas preparações mitocondriais são então submetidas a um protocolo de subfração composto por choque hipotônico (inchaço) e incubação com proteinase K (protease). Durante o inchaço, a membrana mitocondrial externa é seletivamente interrompida, permitindo que a proteinase K digerir proteínas do compartimento espacial intermembrano. Paralelamente, para obter informações sobre a topologia das proteínas da membrana, as preparações mitocondriais são inicialmente sônicas e, em seguida, submetidas à extração alcalina com carbonato de sódio. Finalmente, após a centrifugação, as frações de pelotas e supernasces desses diferentes tratamentos são analisadas por SDS-PAGE e mancha ocidental. A localização subocondrial, bem como a topologia da membrana da proteína de interesse, são obtidas comparando seu perfil de mancha ocidental com padrões conhecidos.

O sucesso do protocolo de fracionamento subocondrial depende da obtenção de mitocôndrias intactas altamente purificadas. Para isso, é essencial que durante a lise celular da levedura, a intactidade das organelas permaneça quase totalmente preservada. Isso é conseguido usando um protocolo de lise celular que combina a digestão enzimática da parede celular seguida pela interrupção física da membrana plasmática usando um homogeneizador do Dounce. Os conteúdos mitocondriais são então coletados por centrifugaç...

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Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Apesar dos avanços recentes, muitas proteínas mitocondriais de levedura ainda permanecem com suas funções completamente desconhecidas. Este protocolo fornece um método simples e confiável para determinar a localização subocondrial das proteínas, o que tem sido fundamental para a elucidação de suas funções moleculares.

Avaliação da Localização da Proteína Subocondrial em Budding Levedura Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Este protocolo é projetado para determinar a localização subocondrial das proteínas mitocondriais de levedura, que é considerada como um passo fundamental durante a elucidação da função proteica mitocondrial. O protocolo é adequado para nossas cepas de levedura mantidas em diferentes condições de crescimento. Representando uma ferramenta poderosa para a pesquisa como o estudo das mitocôndrias.Para começar, células de raia de estoque de glicerol armazenadas a 80 C, em uma placa de ágar YPD para isolar colônias únicas da tensão de interesse. E incubar a placa a 30 C por 2 a 3 dias. Prepare uma cultura inicial inoculando de 2 a 3 colônias individuais de placa de ágar YPD em um frasco de 100 ml Erlenmeyer contendo 10 a 30 ml de meio YPGal.Incubar o frasco a 30 C por 24 horas com agitação vigorosa de 180 a 200 rpm. Diluir a cultura inicial em 1 L de médio YPGal fresco para uma densidade óptica inferior a 0,1 a 600 nm. Cultive as células a 30 C com tremor vigoroso de 180 a 200 rpm por cerca de 12 horas, até que a densidade óptica atinja de 1 a 1,5.Realize o isolamento de mitocôndrias altamente purificadas como descrito no texto. E determinar a concentração proteica da preparação mitocondrial altamente purificada, usando o ensaio de Bradford, seguindo as instruções do fabricante. Ajuste a concentração proteica para 10 mg/ml com tampão SEM gelado.Transfira 40 l de mitocôndrias altamente purificadas em quatro tubos de microcentrifuge pré-refrigerados e rotulados de 1,5 ml. Adicione 360 l de tampão SEM no primeiro e segundo tubos. E 360 l de amortecedor EM no terceiro e quarto tubos.Utilizando o esquema de pipetação, conforme o texto, adicione 4 L de proteínas recém-preparadas no segundo e quarto tubo. Depois de misturar todos os tubos suavemente, incubar no gelo por 30 minutos com mistura ocasional. Para parar a atividade proteinase K adicione 4 L de 200 mM PMSF aos quatro tubos.Centrifugar os tubos a 20.000 x g por 30 minutos a 4 C.E coletar o supernatante, sem perturbar a pelota, em um novo tubo de microcentrifuge prefritado de 1,5 ml. Em seguida, resuspense a pelota em 400 l de tampão SEM gelado. Para inativar os possíveis traços de proteinase K, precipitar o supernanato coletado e resuspensar a pelota com ácido tricloroacético a uma concentração final de 10% Incubar os tubos no gelo por 10 minutos.Centrifugar o ácido tricloroacético tratou amostras por 10 minutos a 12.000 x g a 4 C.E depois de remover o supernascimento, resuspensar a pelota em 200 l de tampão amostral. Se o azul bromofenol ficar amarelo, adicione 1 a 5 l de base 1 M Tris, até ficar azul. Adicione 4 l de 200 mM PMSF a todos os tubos.Armazene as amostras a 80 C até uma análise posterior por SDS-PAGE e mancha ocidental. Transfira 200 l de mitocôndrias altamente purificadas para um tubo de microcentrífuga pré-refrigerado de 1,5 ml. Diluir mitocôndrias uma vez com o tampão SEM gelado.Usando um sonicator compatível com pequenos volumes, mitocôndrias sônicas 3 vezes por 30 segundos no gelo. Centrifugar a amostra por 30 minutos a 100.000 x g a 4 C.E coletar o supernatante em um novo tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 ml. Depois de rotular o tubo como S"para fração de proteína solúvel, mantenha o tubo no gelo.Resuspense a pelota da etapa anterior em 400 l de tampão SEM gelado. Transfira 100 l da pelota resuspended em um novo tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 ml. Rotule o tubo como SMP"para fração de partículas subocondriais e mantenha o tubo no gelo.Diluir os 300 l restantes de pelota resuspended uma dobra com carbonato de sódio de 200 mM recém-preparado. E incubar a amostra diluída no gelo por 30 minutos. Em seguida, centrifufique a amostra por 30 minutos a 100.000 x g a 4 C.Coleça o supernascer em um novo tubo de microcentrifuge pré-refrigerado de 1,5 ml.Rotule a amostra como CS"para fração de sobrenante carbonato, e mantenha o tubo no gelo. Resuspense a pelota da etapa anterior em 400 l de tampão SEM gelado. E nomeie a amostra como CP"para fração precipitada de carbonato.Precipitar todas as amostras com ácido tricloroacético a uma concentração final de 10% e incubar os tubos no gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugar as amostras por 10 minutos a 12.000 x g a 4 C.Depois de remover o supernaspe, resuspense cada pelota no buffer de amostra. Se o tampão de amostra ficar amarelo, adicione 1 a 5 l de base de 1 M Tris até ficar azul.Adicione 1 l de 200 mM PMSF a todos os tubos e armazene a 80 C até uma análise adicional por SDS-PAGE e mancha ocidental. A fração mitocondrial bruta foi purificada na centrifugação gradiente de densidade de sacarose, e observou-se redução em outros contaminantes celulares. Mitocôndrias à conversão mitoplastia foram monitoradas pelo desaparecimento da proteína espacial intermembrana citocromo b2 na pelota.Com a aparência concomitante no supernante. A degradação mediada pela proteinase K da proteína intermembrana Sco1 foi observada devido à interrupção da membrana externa por choque osmótico. A integridade da membrana mitocondrial externa foi confirmada pela proteção do citocromo b2 e Sco1 contra a degradação da proteinase K na fração de pelotas.Da mesma forma, a proteção da proteína solúvel da matriz KGD confirmou a integridade da membrana mitocondrial interna. O perfil da mancha ocidental prx1 sugeriu localização mitocondrial dupla no espaço e matriz intermembrana. Mitocôndrias foram submetidas à sonicação e extração de carbonato para investigar a topologia das proteínas da membrana.O derramamento integral de proteína de membrana permaneceu nas frações de pelotas. O KGD foi detectado na fração supernante. A detecção de proteína KGD na pelota deveu-se a variações de parâmetros de sônica que afetam a formação de SMPs.Após o tratamento de carbonato de sódio, a fração DE KGD e SMP foi solubilizada e encontrada na fração supernante. O perfil da mancha ocidental prx1 sugeriu uma associação com a periferia da membrana. Para o sucesso do protocolo de fracionamento submitocondrial, é importante parar a atividade proteinase K após o inchaço hipotônico adicionando TPM às amostras.Os sites fornecem informações sobre a localização da proteína subocondrial. Este protocolo também pode ser usado para verificar a integridade das preparações mitocondriais, o que é fundamental durante estudos proteômicos de subcomentamentos mitocondriais.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Quantificação de todo o genoma de tradução no fermento Budding pelo Ribossoma perfilamento

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Bioquímica

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Avaliação do impacto da agregação da proteína no estresse oxidativo celular na levedura

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Análise Quantitativa do Lipidome Celular de Saccharomyces Cerevisiae Usando Cromatografia Líquida Juntamente com Espectrometria de Massa de Tandem

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilização de Grafix para a detecção de Interagentes Transintes de Saccharomyces cerevisiae Subcomplexos Spliceosome

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Rotulagem e Visualização de Produtos de Expressão do Genoma Mitocondrial no Saccharomyces cerevisiae de Levedura de Baker

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolômica Quantitativa de Saccharomyces Cerevisiae Usando cromatografia líquida juntamente com espectrometria de massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Análise da Síntese Lipídica Neutra em Saccharomyces cerevisiae por Rotulagem Metabólica e Cromatografia de Camada Fina

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparação e micromaquinção Crio-FIB de Saccharomyces cerevisiae para Tomografia Crio-Elétron

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...