Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Мы благодарим доктора А. Цаголова (Колумбийский университет) за предоставление антител, выращенных против субтохондриальных маркерных белков Cyt. b2, αKGD и Sco1. Мы также благодарим д-ра Марио Энрике де Барроса (Университет Сан-Паулу) за полезное обсуждение и комментарии в ходе разработки этого протокола.
Эта работа была поддержана исследовательскими грантами Фонда ампаро в Пескизе сан-Паулу (FAPESP) (грант 2013/07937-8).
Фернандо Гомес и Хелена Турано также поддерживаются FAPESP, гранты 2017/09443-3 и 2017/23839-7 соответственно. Angélica Ramos также поддерживается Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

1. Рост дрожжевых клеток
<ol><li>Изолируйте отдельные колонии интересующего штамма, переместив небольшую часть клеток из запаса глицерина -80 ° C на агаровую пластину YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы). Инкубировать пластину при 30 °C в течение 2-3 дней. ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм S. cerevisi...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importing+mitochondrial+proteins:+machineries+and+mechanisms.">Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms.</a> Cell. 138 (4), 628-644 (2009).</li><li>Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import:+from+proteomics+to+functional+mechanisms.">Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).</li><li>Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+proteome+and+human+disease.">The mitochondrial proteome and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).</li><li>Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+yeast+mitochondrial+proteome:+Multidimensional+separation+techniques+for+mitochondrial+proteomics.">Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).</li><li>Sickmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteome+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria.">The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).</li><li>V&#246;gtle, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+submitochondrial+protein+distribution.">Landscape of submitochondrial protein distribution.</a> Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+a+high-confidence+mitochondrial+proteome+at+quantitative+scale.">Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale.</a> Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).</li><li>Zahedi, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).</li><li>Gomes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+by+the+inner+membrane+peptidase+(IMP)+complex+or+Oct1+peptidase+controls+the+localization+of+the+yeast+peroxiredoxin+Prx1+to+distinct+mitochondrial+compartments.">Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+Application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Glick, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+c1+and+b2+are+sorted+to+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria+by+a+stop-transfer+mechanism.">Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism.</a> Cell. 69 (5), 809-822 (1992).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

Представленный здесь протокол успешно используется и непрерывно оптимизируется в течение длительного времени для определения локализации белка в притохондриальных компартментах13,14,18,21,22,23.</sup...

Митохондрии являются важнейшими органеллами эукариотических клеток, которые играют решающую роль в биоэнергетике, клеточном метаболизме и сигнальных путях1. Для правильного выполнения этих задач митохондрии полагаются на уникальный набор белков и липидов, отвечающих за их структуру и функцию. Почковые дрожжи Saccharomyces cerevisiae широко используются в качестве модельной системы для исследований митохондриальных процессов, а также для других органелл2. Митохондриальный геном кодирует только восемь белков в дрожжах; подавляющее большинство митохондриальных белков (~99%) кодируются ядерными генами, которые транслируются на цитозольных рибосомах, а затем импортируются в их правильные притохондриальные компартменты сложными механизмами импорта белка3,4,5. Таким образом, митохондриальный биогенез зависит от скоординированной экспрессии как ядерного, так и митохондриального геномов6,7. Генетические мутации, вызывающие дефекты митохондриального биогенеза, связаны с заболеваниями человека8,9,10.
За последние два десятилетия высокопроизводительные протеомные исследования, нацеленные на высокоочищенные митохондрии, привели к всесторонней характеристике дрожжевого митохондриального протеома, который, по оценкам, состоит из не менее 900 белков11,12,13,14. Хотя эти исследования предоставили ценную информацию, суборганелларная локализация каждого белка в четырех митохондриальных подкомпартментах, а именно внешней мембране (OM), межмембранном пространстве (IMS), внутренней мембране (IM) и матрице, все еще требуется. Этот вопрос был частично решен с помощью протеомных исследований двух меньших митохондриальных подкомпартментов (OM и IMS)15,16. Совсем недавно Vögtle и его коллеги сделали большой шаг вперед, создав высококачественную глобальную карту распределения субтохондриального белка в дрожжах. Используя комплексный подход, сочетающий количественную масс-спектрометрию на основе SILAC, различные протоколы фракционирования постохондрий и набор данных из протеомов OM и IMS, авторы выделили 818 белков в четыре митохондриальных подкомпартмента13.
Несмотря на успехи, достигнутые этими высокопроизводительными протеомными исследованиями, наши знания о составе протеома постохондрий далеко не полны. Действительно, среди 986 белков, о которых Vögtle и его коллеги сообщили как локализованные в дрожжевых митохондриях, 168 не могли быть отнесены ни к одному из четырех подсоландохондриальных компартментов13. Более того, авторы не предоставили информацию о мембранной топологии белков, которые, как прогнозировалось, будут периферически прикреплены к периферии митохондриальных мембран. Например, невозможно узнать, обращен ли белок, который был назначен периферически прикрепленным к внутренней мембране, к матрице или межмембранному пространству. Помимо этих недостающих данных из общепротеомных исследований, есть противоречивая информация о суборганелларной локализации значительного числа митохондриальных белков. Одним из примеров является протеаза Prd1, которая была назначена в качестве межмембранного космического белка в общих базах данных, таких как Saccharomyces Genome Database (SGD) и Uniprot. Удивительно, но используя протокол субфракционации, подобный описанному здесь, Фёгтле и его коллеги ясно показали, что Prd1 является подлинным матричным белком13. Как упоминалось выше, необходимо прояснить или переоценить субтохондриальную локализацию многих митохондриальных белков. Здесь мы предоставляем простой и надежный протокол для определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков. Этот протокол был разработан и оптимизирован различными исследовательскими группами и регулярно используется для определения локализации постохондрий, а также мембранной топологии многих митохондриальных белков.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

Несмотря на недавние успехи в характеристике митохондриального протеома дрожжей, субпохондриальная локализация значительного числа белков остается неуловимой. Здесь мы описываем надежный и эффективный метод определения суборганелларной локализации дрожжевых митохондриальных белков, который считается фундаментальным шагом при выяснении функции митохондриального белка. Этот метод включает в себя начальный этап, который заключается в получении высокочистых интактных митохондрий. Эти митохондриальные препараты затем подвергают протоколу субфракционации, состоящему из гипотонического шока (отека) и инкубации с протеиназой К (протеазой). Во время отека внешняя митохондриальная мембрана избирательно нарушается, позволяя протеиназе К переваривать белки межмембранного космического отсека. Параллельно для получения информации о топологии мембранных белков митохондриальные препараты сначала обрабатывают ультразвуком, а затем подвергают щелочной экстракции карбонатом натрия. Наконец, после центрифугирования фракции гранул и супернатантов из этих различных обработок анализируются с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Постохондриальная локализация, а также мембранная топология интересующего белка получены путем сравнения его западного блот-профиля с известными стандартами.

Успех протокола субтохондриального фракционирования зависит от получения высокоочищенных интактных митохондрий. Для этого важно, чтобы во время лизиса дрожжевых клеток целостность органелл оставалась почти полностью сохраненной. Это достигается с помощью протокола лизиса клеток, к...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Несмотря на недавние достижения, многие дрожжевые митохондриальные белки по-прежнему остаются со своими функциями совершенно неизвестными. Этот протокол обеспечивает простой и надежный метод определения субтохондриальной локализации белков, который был основополагающим для выяснения их молекулярных функций.

Оценка локализации субпохондриального белка в почковых дрожжах Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Этот протокол предназначен для определения постохондриальной локализации дрожжевых митохондриальных белков, которая рассматривается как фундаментальный этап при выяснении функции митохондриального белка. Протокол подходит для наших штаммов дрожжей, поддерживаемых в различных условиях роста. Представляя собой мощный инструмент для исследований, как изучение митохондрий.Начнем с того, что клетки из запаса глицерина, хранящегося при 80 ° C, попадают на агаровую пластину YPD, чтобы изолировать отдельные колонии от интересующего штамма. И высиживать пластину при 30 С в течение 2 - 3 дней. Приготовьте закваску, инокуляя от 2 до 3 отдельных колоний из агаровой пластины YPD в колбу Эрленмейера объемом 100 мл, содержащую от 10 до 30 мл среды YPGal.Инкубируйте колбу при 30 С в течение 24 часов с энергичным встряхиванием при 180-200 об/мин. Разбавляют закваски в 1 л свежей среды YPGal до оптической плотности менее 0,1 при 600 нм. Культивируют клетки при 30 С с энергичным встряхиванием при 180-200 об/мин в течение примерно 12 часов, пока оптическая плотность не достигнет от 1 до 1,5.Выполняют выделение высокоочищенных митохондрий, как описано в тексте. И определить концентрацию белка высокоочищенного митохондриального препарата, используя анализ Брэдфорда, следуя инструкциям производителя. Отрегулируйте концентрацию белка до 10 мг/мл с помощью ледяного буфера SEM.Переложите 40 л высокоочищенных митохондрий в четыре предварительно охлажденные и меченые микроцентрифужные трубки по 1,5 мл. Добавьте 360 л SEM-буфера в первую и вторую пробирки. И 360 л ЭМ-буфера в третьей и четвертой пробирках.Используя схему пипетирования, согласно тексту, добавляют 4 л свежеприготовленной протеиназы К во вторую и четвертую пробирки. После осторожного перемешивания всех пробирок высиживать на льду в течение 30 минут с периодическим перемешиванием. Для остановки активности протеиназы К добавляют во все четыре пробирки 4 л 200 мМ PMSF.Центрифугируйте пробирки по 20 000 х г в течение 30 минут при 4 С. И соберите супернатант, не нарушая гранулу, в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Затем повторно суспендируйте гранулу в 400 л ледяного SEM-буфера. Чтобы инактивировать возможные следы протеиназы К, осадите собранный супернатант и повторно суспендируйте гранулу трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 10%, инкубируйте пробирки на льду в течение 10 минут.Центрифугируют обработанные трихлоруксусной кислотой образцы в течение 10 минут при 12 000 х г при 4 С. А после удаления супернатанта повторно суспендируют гранулу в 200 л буфера образца. Если бромфенол синий становится желтым, добавьте от 1 до 5 л основания 1 M Tris, пока оно не станет синим. Добавьте 4 л 200 мМ PMSF ко всем пробиркам.Храните образцы при температуре 80 ° C до дальнейшего анализа с помощью SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Переложите 200 л высокоочищенных митохондрий в предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Разбавьте митохондрии в один раз ледяным буфером SEM.Используя ультразвуковой аппарат, совместимый с небольшими объемами, обрабатывайте митохондрии ультразвуком 3 раза в течение 30 секунд на льду. Центрифугируйте образец в течение 30 минут при 100 000 х г при 4 С. И соберите супернатант в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. После маркировки трубки как S" для растворимой белковой фракции держите трубку на льду.Повторное суспендирование гранулы с предыдущей стадии в 400 л ледяного SEM-буфера. Переложите 100 л повторно суспендированной гранулы в новую пробирку предварительно охлажденной микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Пометьте трубку как SMP" для фракции постохондриальных частиц и держите трубку на льду.Оставшиеся 300 л повторно суспендированных гранул раз разбавить свежеприготовленным 200 мМ карбонатом натрия. И высиживать разбавленный образец на льду в течение 30 минут. Затем центрифугируйте образец в течение 30 минут при 100 000 х г при 4 С. Соберите супернатант в новую предварительно охлажденную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.Пометьте образец как CS" для фракции карбонатного супернатанта и держите трубку на льду. Повторное суспендирование гранулы с предыдущей стадии в 400 л ледяного SEM-буфера. И назовите образец CP" для карбонатной осажденной фракции.Осадите все образцы трихлоруксусной кислотой до конечной концентрации 10% и инкубируйте трубки на льду в течение 10 минут. Затем центрифугируют образцы в течение 10 минут при 12 000 х г при 4 С. После удаления супернатанта повторно суспендируют каждую гранулу в буфере образца. Если буфер образца становится желтым, добавьте от 1 до 5 л основания 1 M Tris, пока оно не станет синим.Добавьте 1 л 200 мМ PMSF ко всем пробиркам и храните при 80 ° C до дальнейшего анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга. Сырую митохондриальную фракцию очищали при центрифугировании градиента плотности сахарозы и наблюдалось уменьшение других клеточных загрязнений. Превращение митохондрий в митопласт контролировали исчезновением межмембранного космического белка цитохрома b2 в грануле.С сопутствующим появлением в супернатанте. Опосредованная протеиназой К деградация межмембранного белка Sco1 наблюдалась из-за разрушения наружной мембраны осмотическим шоком. Целостность внешней митохондриальной мембраны была подтверждена защитой цитохрома b2 и Sco1 от деградации протеиназы K в гранулированной фракции.Аналогичным образом, защита матриксного растворимого белка KGD подтвердила целостность внутренней митохондриальной мембраны. Профиль западного пятна Prx1 предполагал двойную митохондриальную локализацию в межмембранном пространстве и матрице. Митохондрии подвергали ультразвуковой обработке и карбонатной экстракции для исследования топологии мембранных белков.Интегральная мембранная белковая заливка осталась в гранулированных фракциях. КГД был обнаружен в надводной фракции. Обнаружение белка KGD в гранулах было обусловлено изменениями параметров ультразвуковой обработки, влияющими на образование SMP.После обработки карбонатом натрия KGD и фракцию SMP солюбилизировали и обнаружили в фракции надосадочных веществ. Профиль западного пятна Prx1 предполагает ассоциацию с периферией мембраны. Для успеха протокола индохондриального фракционирования важно остановить активность протеиназы К после гипотонического отека путем добавления PMSF в образцы.Сайты предоставляют информацию о локализации белка субтохондрий. Этот протокол также может быть использован для проверки целостности митохондриальных препаратов, что является фундаментальным при протеомных исследованиях митохондриальных подкомпартментов.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Геном широкий количественная оценка перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Оценка влияния агрегации белков на сотовой окислительный стресс в дрожжи

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Экран 2-гибрид дрожжи в пакете для сравнения взаимодействий протеина

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественный анализ клеточного липидома Сахаромиса Церевизии с использованием жидкой хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Использование Grafix для обнаружения переходных интеракторов Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Маркировка и визуализация продуктов экспрессии митохондриального генома в хлебобулочных saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Количественная метаболомика Saccharomyces Cerevisiae с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Анализ синтеза нейтральных липидов в Saccharomyces cerevisiae методом метаболической маркировки и тонкослойной хроматографии

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Подготовка и крио-FIB микрообработка Saccharomyces cerevisiae для криоэлектронной томографии

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...