Name: assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2021-07-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Vi tackar Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) för att tillhandahålla antikroppar som höjts mot submitochondriella markörproteiner Cyt. b2, αKGD och Sco1. Vi tackar också Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) för hjälpsam diskussion och kommentarer under upprättandet av detta protokoll.
Detta arbete stöddes av forskningsanslag från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (anslag 2013/07937-8).
Fernando Gomes och Helena Turano stöds också av FAPESP, bidrag 2017/09443-3 respektive 2017/23839-7. Angélica Ramos stöds också av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

1. Tillväxt av jästceller
<ol><li>Isolera enstaka kolonier av intressestammen genom att strimla en liten del av cellerna från en -80 °C glycerolbuljong på en YPD (1% jästextrakt, 2% pepton, 2% glukos) agarplatta. Inkubera plattan vid 30 °C i 2-3 dagar. OBS: S. cerevisiae-stammen som används i detta protokoll härrör från BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Med undantag för de auxotrofa markörgenerna...

<ol>
	<li>Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+proteins:+from+biogenesis+to+functional+networks.">Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).</li><li>Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+mitochondria:+An+overview+of+mitochondrial+biology+and+the+potential+of+mitochondrial+systems+biology.">Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology.</a> FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).</li><li>Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importing+mitochondrial+proteins:+machineries+and+mechanisms.">Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms.</a> Cell. 138 (4), 628-644 (2009).</li><li>Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+import:+from+proteomics+to+functional+mechanisms.">Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).</li><li>Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+mitochondrial+and+cytosolic+translation+programs.">Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs.</a> Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).</li><li>Richter-Dennerlein, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+synthesis+adapts+to+influx+of+nuclear-encoded+protein.">Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein.</a> Cell. 167 (2), 471-483 (2016).</li><li>Suomalainen, A., Battersby, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+diseases:+The+contribution+of+organelle+stress+responses+to+pathology.">Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).</li><li>Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease-associated+genetic+variation+in+human+mitochondrial+protein+import.">Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).</li><li>Calvo, S. E., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+proteome+and+human+disease.">The mitochondrial proteome and human disease.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).</li><li>Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+the+complete+yeast+mitochondrial+proteome:+Multidimensional+separation+techniques+for+mitochondrial+proteomics.">Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).</li><li>Sickmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proteome+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria.">The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).</li><li>V&#246;gtle, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Landscape+of+submitochondrial+protein+distribution.">Landscape of submitochondrial protein distribution.</a> Nature Communications. 8 (1), 00359 (2017).</li><li>Morgenstern, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+a+high-confidence+mitochondrial+proteome+at+quantitative+scale.">Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale.</a> Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).</li><li>Zahedi, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+yeast+mitochondrial+outer+membrane+reveals+accumulation+of+a+subclass+of+preproteins.">Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).</li><li>V&#246;gtle, F. -. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermembrane+space+proteome+of+yeast+mitochondria.">Intermembrane space proteome of yeast mitochondria.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).</li><li>Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+mitochondria+from+yeast+cells.">Purification of mitochondria from yeast cells.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417 (2009).</li><li>Boldogh, I. R., Pon, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).</li><li>Gomes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+by+the+inner+membrane+peptidase+(IMP)+complex+or+Oct1+peptidase+controls+the+localization+of+the+yeast+peroxiredoxin+Prx1+to+distinct+mitochondrial+compartments.">Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+Application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum.</a> Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Glick, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+c1+and+b2+are+sorted+to+the+intermembrane+space+of+yeast+mitochondria+by+a+stop-transfer+mechanism.">Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism.</a> Cell. 69 (5), 809-822 (1992).</li><li>Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).</li><li>Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathways+and+energetics+of+mitochondrial+protein+import+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).</li><li>Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Saccharomcyes+cerevisiae+mitochondria+devoid+of+microsomal+and+cytosolic+contaminations.">Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations.</a> Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).</li><li>Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+yeast+mitochondria.">Isolation of yeast mitochondria.</a> Methods in molecular biology. 313 (1), 33-39 (2006).</li><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tim29+is+a+novel+subunit+of+the+human+TIM22+translocase+and+is+involved+in+complex+assembly+and+stability.">Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability.</a> eLife. 5, 17463 (2016).</li><li>Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+disulfide+bonds+reveals+an+evolutionarily+conserved+mechanism+involved+in+mitochondrial+protein+translocase+assembly.">The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly.</a> Scientific Reports. 6, 27484 (2016).</li><li>Callegari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIM29+is+a+subunit+of+the+human+carrier+translocase+required+for+protein+transport.">TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport.</a> FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).</li><li>Neupert, W., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+proteins+into+mitochondria.">Translocation of proteins into mitochondria.</a> Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).</li><li>Meineke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outer+membrane+form+of+the+mitochondrial+protein+Mcr1+follows+a+TOM-independent+membrane+insertion+pathway.">The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway.</a> FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).</li></ol>

Protokollet som presenteras här har framgångsrikt använts och kontinuerligt optimerats under lång tid för att bestämma proteinlokaliseringen i de inochondriella facken13,14,18,21,22,23. Tillförlitligheten och reproducerbarheten av detta protokoll är starkt beroende av renheten och integriteten hos mitokondriella <sup ...

Mitokondrier är viktiga organeller av eukaryota celler som spelar avgörande roller i bioenergetik, cellulär metabolism och signaleringsvägar1. För att korrekt utföra dessa uppgifter förlitar sig mitokondrier på en unik uppsättning proteiner och lipider som ansvarar för deras struktur och funktion. Den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae har använts i stor utsträckning som modellsystem för undersökningar av mitokondriella processer, liksom för andra organeller2. Mitokondriellt genom kodar för endast åtta proteiner i jäst; De allra flesta mitokondriella proteiner (~99%) kodas av nukleära gener, som översätts på cytosola ribosomer, och därefter importeras till sina korrekta inochondriella fack av sofistikerade proteinimportmaskiner3,4,5. Således är mitokondriell biogenes beroende av det samordnade uttrycket av både det nukleära och mitokondriella genomet6,7. Genetiska mutationer orsakar defekter i mitokondriell biogenes är associerade med mänskliga sjukdomar8,9,10.
Under de senaste två decennierna har proteomiska studier med hög genomströmning riktade mot högrenade mitokondrier resulterat i en omfattande karakterisering av jäst mitokondriell proteom, som har uppskattats bestå av minst 900 proteiner11,12,13,14. Även om dessa studier gav värdefull information, krävs suborganellar lokalisering av varje protein i de fyra mitokondriella underparterna, nämligen det yttre membranet (OM), intermembrane space (IMS), inre membran (IM) och matris, fortfarande. Denna fråga behandlades delvis med proteomisk-omfattande studier av de två mindre mitokondriella underparterna (OM och IMS)15,16. På senare tid har Vögtle och samarbetspartners tagit ett stort steg framåt genom att ta fram en högkvalitativ global karta över inochondriell proteindistribution i jäst. Med hjälp av en integrerad metod som kombinerar SILAC-baserad kvantitativ masspektrometri, olika inochondriella fraktioneringsprotokoll och datauppsättningen från OM- och IMS-proteomerna, tilldelade författarna 818 proteiner till de fyra mitokondriella underparterna13.
Trots de framsteg som uppnåtts av dessa proteomiska studier med hög genomströmning är vår kunskap om den inochondriella proteomkompositionen långt ifrån fullständig. Bland 986 proteiner som rapporterats av Vögtle och kollaboratörer som lokaliserade till jäst mitokondrier, kunde 168 inte tilldelas i något av de fyra submitochondrial facken13. Dessutom gav författarna inte information om membran topologin av proteiner som förutspåddes vara perifert fäst vid periferin av mitokondriella membran. Det är till exempel inte möjligt att veta om ett protein som tilldelades som perifert fäst vid det inre membranet är vänd mot matrisen eller det intermembrana utrymmet. Bortsett från dessa saknade data från de proteomomfattande studierna finns det motstridig information om suborganellar lokalisering av ett betydande antal mitokondriella proteiner. Ett exempel är proteasen Prd1, som har tilldelats som ett intermembran rymdprotein i de gemensamma databaserna som Saccharomyces Genome Database (SGD) och Uniprot. Överraskande, med hjälp av ett subfractionation protokoll som liknar det som beskrivs här, visade Vögtle och kollaboratörer tydligt att Prd1 är en äkta matrisprotein13. Som nämnts ovan måste den inochondriella lokaliseringen av många mitokondriella proteiner klargöras eller omvärderas. Här tillhandahåller vi ett enkelt och tillförlitligt protokoll för att bestämma suborganellar lokalisering av jäst mitokondriella proteiner. Detta protokoll utvecklades och optimerades av olika forskargrupper och har rutinmässigt använts för att bestämma den inochondriella lokaliseringen, liksom membrantopologin hos många mitokondriella proteiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>BD</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast extract</td>
			<td>BD</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA fatty acid free)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>Component of Homogenization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>43815</td>
			<td>Component of DDT buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Used to inactivate proteinase K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase-20T from Arthrobacter luteus</td>
			<td>MP Biomedicals, Irvine, CA</td>
			<td>320921</td>
			<td>Used to lyse living yeast cell walls to produce spheroplast</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of submitochondrial protein localization in budding yeast saccharomyces cerevisiae

Trots de senaste framstegen i karakteriseringen av jäst mitokondriellt proteom, är den inochondriella lokaliseringen av ett betydande antal proteiner fortfarande svårfångad. Här beskriver vi en robust och effektiv metod för att bestämma suborganellar lokalisering av jäst mitokondriella proteiner, som anses vara ett grundläggande steg under mitokondriell protein funktion klarering. Denna metod innebär ett första steg som består av att erhålla mycket ren intakt mitokondrier. Dessa mitokondriella preparat utsätts sedan för ett subfractionationsprotokoll bestående av hypoton chock (svullnad) och inkubation med proteinas K (proteas). Under svullnad störs det yttre mitokondriella membranet selektivt, vilket gör det möjligt för proteinaset K att smälta proteiner i det intermembrana rymdutrymmet. Parallellt, för att få information om topologin av membranproteiner, soniskas först mitokondriella preparat och utsätts sedan för alkalisk extraktion med natriumkarbonat. Slutligen, efter centrifugering, analyseras pellet- och supernatantfraktionerna från dessa olika behandlingar av SDS-PAGE och western blot. Den submitochondriella lokaliseringen samt membrantopologin hos proteinet av intresse erhålls genom att jämföra dess västra fläckprofil med kända standarder.

Framgången för submitochondrial fraktionering protokoll beror på att erhålla högt renade intakt mitokondrier. För detta är det viktigt att under jästcelllysen förblir organellernas intakthet nästan helt bevarad. Detta uppnås genom att använda ett celllysprotokoll som kombinerar cellväggens enzymatiska matsmältning följt av fysisk störning av plasmamembranet med hjälp av en Dounce homogenisator. Mitokondriellt innehåll samlas sedan in genom differentiell centrifugering. Denna subcellulära fraktionering ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Trots de senaste framstegen finns många jäst mitokondriella proteiner fortfarande kvar med sina funktioner helt okända. Detta protokoll ger en enkel och pålitlig metod för att bestämma den inochondriella lokaliseringen av proteiner, vilket har varit grundläggande för att klargöra deras molekylära funktioner.

Bedömning av inochondriell proteinlokalisering i spirande jäst sackaromyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Detta protokoll är utformat för att bestämma den inochondriella lokaliseringen av jäst mitokondriella proteiner, vilket anses vara ett grundläggande steg under mitokondriell proteinfunktionsjämförelse. Protokollet är lämpligt för våra jäststammar som upprätthålls under olika tillväxtförhållanden. Representerar ett kraftfullt verktyg för forskning som att studera mitokondrier.Till att börja med, strimmig celler från glycerol lager lagras vid 80 C, på en YPD agar tallrik för att isolera enskilda kolonier från stammen av intresse. Och inkubera plattan vid 30 C i 2 till 3 dagar. Förbered en startkultur genom att inokurera 2 till 3 enskilda kolonier från YPD agarplatta i en 100 ml Erlenmeyerkolv som innehåller 10–30 ml YPGal-medium.Inkubera kolven vid 30 C i 24 timmar med kraftig skakning vid 180 till 200 varv/min. Späd ut startkulturen till 1 L färskt YPGal-medium till en optisk densitet mindre än 0,1 vid 600 nm. Odla cellerna vid 30 C med kraftig skakning vid 180 till 200 varv/min i ca 12 timmar tills den optiska densiteten når 1 till 1,5.Utför isoleringen av högt renade mitokondrier som beskrivs i texten. Och bestäm proteinkoncentrationen av den mycket renade mitokondriella beredningen, med hjälp av Bradford-analysen, enligt tillverkarens instruktioner. Justera proteinkoncentrationen till 10 mg/ml med iskall SEM-buffert.Överför 40 l högrenade mitokondrier till fyra 1,5 ml förkylda och märkta mikrocentrifugerör. Tillsätt 360 l SEM-buffert i det första och andra röret. Och 360 liter EM-buffert i tredje och fjärde rören.Använd pipetteringsschemat, enligt texten, tillsätt 4 L nyberedd proteinas K i det andra och fjärde röret. Efter att ha blandat alla rör försiktigt, inkubera på is i 30 minuter med tillfällig blandning. För att stoppa proteinas K-aktivitet tillsätt 4 L 200 mM PMSF till alla fyra rören.Centrifugera rören vid 20 000 x g i 30 minuter vid 4 C.Och samla supernatanten, utan att störa pelleten, i ett nytt 1,5 ml förkylt märkt mikrocentrifugerör. Därefter återanvänder du pelleten i 400 l iskall SEM-buffert. För att inaktivera de möjliga spåren av proteinas K fäller du ut det insamlade supernatantmedlet och återanvänder pelleten med trikloreättisk syra till en slutlig koncentration av 10%Inkubera rören på is i 10 minuter.Centrifugera de trikloritetiksyrabehandlade proverna i 10 minuter vid 12 000 x g vid 4 C.Och efter att ha avlägsnat supernatanten, återanvänd pelleten i 200 l provbuffert. Om bromofenolblå blir gul, tillsätt 1 till 5 l av 1 M Tris-basen tills den blir blå. Tillsätt 4 l av 200 mM PMSF till alla rör.Förvara proverna vid 80 C tills vidare analys av SDS-PAGE och western blot. Överför 200 l högrenad mitokondrier till ett 1,5 ml förkylt mikrocentrifugerör. Späd mitokondrierna enfaldigt med iskall SEM-buffert.Med hjälp av en sonicator kompatibel med små volymer, sonicate mitokondrier 3 gånger i 30 sekunder på is. Centrifugera provet i 30 minuter vid 100 000 x g vid 4 C.Och samla supernatanten i ett nytt 1,5 ml förkylt mikrocentrifugerör. Efter märkning av röret som S"för löslig proteinfraktion, håll röret på is.Återanvänd pelleten från föregående steg i 400 l iskall SEM-buffert. Överför 100 l av den återanvända pelleten till ett nytt 1,5 ml förkylt mikrocentrifugerör. Märk röret som SMP"för fraktionion av inochondriella partiklar och håll röret på is.Späd ut de återstående 300 l av återsuspenderad pellet enfaldigt med nyberedd 200 mM natriumkarbonat. Och inkubera det utspädda provet på is i 30 minuter. Centrifugera sedan provet i 30 minuter vid 100 000 x g vid 4 C.Samla sedan supernatanten i ett nytt 1,5 ml förkylt mikrocentrifugerör.Märk provet som CS"för karbonat supernatantfraktion och håll röret på is. Återanvänd pelleten från föregående steg i 400 l iskall SEM-buffert. Och namnge provet som CP"för karbonat fälld fraktion.Fäll ut alla prover med trikloreättisk syra till en slutlig koncentration på 10% och inkubera rören på is i 10 minuter. Centrifugera sedan proverna i 10 minuter vid 12 000 x g vid 4 C.Efter att supernatanten har tagits bort ska du återanvända varje pellet i provbufferten. Om provbufferten blir gul, tillsätt 1 till 5 l av 1 M Tris-basen tills den blir blå.Tillsätt 1 l av 200 mM PMSF till alla rör och förvara vid 80 C tills vidare analys av SDS-PAGE och western blot. Rå mitokondriell fraktionen renades på sackaros densitet gradient centrifugering, och minskning av andra cellulära föroreningar observerades. Mitokondrier till mitoplast omvandling övervakades av försvinnandet av intermembrane utrymme protein cytokrom b2 i pelleten.Med det samtidiga utseendet i supernatanten. Proteinas K medierad nedbrytning av intermembrane protein Sco1 observerades på grund av att yttre membran störningar av osmotic chock. Den yttre mitokondriell membran integritet bekräftades av skyddet av cytokrom b2 och Sco1 mot proteinas K nedbrytning i pellet fraktionen.På samma sätt bekräftade skyddet av matrislösliga protein KGD den inre mitokondriella membran integriteten. Prx1 västra blot profil föreslog dubbla mitokondriell lokalisering i intermembrane utrymme och matris. Mitokondrier utsattes för ultraljudsbehandling och karbonat extraktion för att undersöka topologin av membran proteiner.Den integrerade membranproteinhällningen förblev i pelletsfraktionerna. KGD upptäcktes i supernatant fraktionen. Detektion av KGD protein i pellet berodde på ultraljudsbehandling parameter variationer som påverkar bildandet av SMPs.Efter natriumkarbonat behandling, KGD och SMP fraktionen var solubilized och hittades i supernatant fraktionen. Prx1 västra blot profil föreslog en associering med membran periferi. För att submitochondrial fraktionering protokollet, det är viktigt att stoppa proteinas K verksamhet efter hypoton svullnad genom att lägga PMSF till proverna.Webbplatser ger information om den inochondriella proteinlokaliseringen. Detta protokoll kan också användas för att kontrollera integriteten hos mitokondriella preparat, vilket är grundläggande under proteomiska studier av mitokondriella underparter.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Utvärdering av effekten av Protein Aggregation på cellulära oxidativ Stress i jäst

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

En jäst 2-Hybrid skärm i Batch att jämföra proteininteraktioner

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Analysis of the Cellular Lipidome of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ analys av cellulär lipidom e av Saccharomyces Cerevisiae med hjälp av flytande kromatografi tillsammans med Tandem Mass Spectrometri

Lipids are structurally diverse amphipathic molecules that are insoluble in water. Lipids are essential contributors to the organization and function of ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Användning av Grafix för påvisande av transienta interactorer av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Märkning och visualisering av mitokondriella genomuttrycksprodukter i bagerijäst Saccharomyces cerevisiae

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Kvantitativ metabolomik av sackaromyces Cerevisiae med flytande kromatografi i kombination med tandemmasspektrometri

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Analys av neutral lipidsyntes i Sackaromyces cerevisiae av metabolisk märkning och tunnskiktskromatografi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Förberedelse och Kryo-FIB mikromachining av Saccharomyces cerevisiae för Cryo-Electron Tomography

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...