Denne protokollen er designet for å bestemme den submitochondriale lokaliseringen av gjær mitokondrieproteiner, som regnes som et grunnleggende skritt under mitokondrieproteinfunksjonsucidasjon. Protokollen er egnet for våre gjærstammer opprettholdt under forskjellige vekstforhold. Representerer et kraftig verktøy for forskning som studere mitokondrier.
Til å begynne med, strekke celler fra glyserol lager lagret ved 80 C, på en YPD agar plate for å isolere enkeltkolonier fra stammen av interesse. Og inkuber platen ved 30 C i 2 til 3 dager. Forbered en startkultur ved å inokulere 2 til 3 individuelle kolonier fra YPD agar plate i en 100 ml Erlenmeyer kolbe som inneholder 10 til 30 ml YPGal medium.
Inkuber kolben ved 30 C i 24 timer med kraftig risting ved 180 til 200 rpm. Fortynn startkulturen i 1 L friskt YPGal-medium til en optisk tetthet mindre enn 0,1 ved 600 nm. Dyrk cellene ved 30 C med kraftig risting ved 180 til 200 rpm i ca 12 timer, til optisk tetthet når 1 til 1,5.
Utfør isolasjonen av svært rensede mitokondrier som beskrevet i teksten. Og bestem proteinkonsentrasjonen av det svært rensede mitokondriepreparatet, ved hjelp av Bradford-analysen, etter produsentens instruksjoner. Juster proteinkonsentrasjonen til 10 mg/ml med iskald SEM-buffer.
Overfør 40 l svært rensede mitokondrier til fire 1,5 ml forhåndskjølte og merkede mikrocentrifugerør. Tilsett 360 l SEM-buffer i første og andre rør. Og 360 l EM-buffer i tredje og fjerde rør.
Ved hjelp av pipetteringsskjemaet, i henhold til teksten, tilsett 4 L nylaget proteinase K i andre og fjerde rør. Etter å ha blandet alle rørene forsiktig, inkuber på is i 30 minutter med sporadisk blanding. For å stoppe proteinase K aktivitet legge 4 L av 200 mM PMSF til alle fire rør.
Sentrifuger rørene ved 20.000 x g i 30 minutter ved 4 C.Og samle supernatanten, uten å forstyrre pelletsen, i et nytt 1,5 ml forhåndskjølt merket mikrocentrifugerør. Deretter resuspenderer du pelletsen i 400 liter iskald SEM-buffer. For å inaktivere de mulige sporene av proteinase K, utfell den oppsamlede supernatanten og resuspender pellet med trikloreddiksyre til en endelig konsentrasjon på 10%Inkuber rørene på is i 10 minutter.
Sentrifuger de trichloroacetic syrebehandlede prøvene i 10 minutter ved 12.000 x g ved 4 C.Og etter å ha fjernet supernatanten, resuspend pellet i 200 l prøvebuffer. Hvis bromofenolblå blir gul, tilsett 1 til 5 l 1 M Tris base, til den blir blå. Tilsett 4 l 200 mM PMSF til alle rørene.
Oppbevar prøvene ved 80 C inntil videre analyse av SDS-PAGE og western blot. Overfør 200 liter svært renset mitokondrier til et 1,5 ml forkjølt mikrocentrifugerør. Fortynn mitokondrier enfoldig med iskald SEM-buffer.
Ved hjelp av en soniker som er kompatibel med små volumer, sonikerer mitokondrier 3 ganger i 30 sekunder på is. Sentrifuger prøven i 30 minutter ved 100 000 x g ved 4 C.Og samle supernatanten i et nytt 1,5 ml forkjølt mikrosenterrør. Etter å ha merket røret som S"for løselig proteinfraksjon, hold røret på is.
Resuspend pellet fra forrige trinn i 400 l iskald SEM buffer. Overfør 100 l av den resuspenderte pellet til et nytt 1,5 ml forkjølt mikrosenterrør. Merk røret som SMP"for sendokondriepartikler brøkdel, og hold røret på is.
Fortynn de resterende 300 liter resuspendert pellet enfold med nytilberedt 200 mM natriumkarbonat. Og inkuber den fortynnede prøven på is i 30 minutter. Deretter sentrifugerer du prøven i 30 minutter ved 100 000 x g ved 4 C.Collect supernatanten i et nytt 1,5 ml forkjølt mikrosenterrør.
Merk prøven som CS"for karbonat supernatant brøkdel, og hold røret på is. Resuspend pellet fra forrige trinn i 400 l iskald SEM buffer. Og navngi prøven som CP"for karbonat utfelt brøkdel.
Utfell alle prøvene med trikloredsyre til en endelig konsentrasjon på 10%og inkuber rørene på is i 10 minutter. Deretter sentrifugerer du prøvene i 10 minutter ved 12 000 x g ved 4 C.Etter at du har fjernet supernatanten, bruker du hver pellets på nytt i prøvebufferen. Hvis prøvebufferen blir gul, legger du til 1 til 5 l 1 M Tris-base til den blir blå.
Tilsett 1 l 200 mM PMSF i alle rørene og lagre ved 80 C inntil videre analyse av SDS-PAGE og western blot. Den rå mitokondriefraksjonen ble renset på sukrosetetthet gradient sentrifugering, og reduksjon i andre cellulære forurensninger ble observert. Mitokondrier til mitokriske konvertering ble overvåket av forsvinningen av intermembrane romprotein cytokrom b2 i pellets.
Med det samtidige utseendet i supernatanten. Proteinase K mediert nedbrytning av intermembrane protein Sco1 ble observert på grunn av ytre membranforstyrrelser ved osmotisk sjokk. Den ytre mitokondriemembranintegriteten ble bekreftet ved beskyttelse av cytokrom b2 og Sco1 mot proteinase K nedbrytning i pelletsfraksjonen.
På samme måte bekreftet beskyttelsen av matriseløselig protein KGD den indre mitokondriemembranintegriteten. Prx1 western blot profil foreslo dobbel mitokondrie lokalisering i intermembrane plass og matrise. Mitokondrier ble utsatt for sonikering og karbonatutvinning for å undersøke topologien til membranproteiner.
Det integrerte membranproteinet som helles forble i pelletsfraksjonene. KGD ble oppdaget i den supernatante fraksjonen. Påvisning av KGD-protein i pellet skyldtes sonikeringsparametervariasjoner som påvirker dannelsen av SMB-er.
Etter natriumkarbonatbehandling ble KGD og SMP-fraksjonen solubilisert og funnet i den supernatante fraksjonen. Prx1 vestlig blot profil foreslo en tilknytning til membran periferi. For suksessen til den sendende fraksjoneringsprotokollen er det viktig å stoppe proteinase K-aktivitet etter hypotonisk hevelse ved å legge PMSF til prøvene.
Nettsteder gir informasjon om lokalisering av submitochondrialprotein. Denne protokollen kan også brukes til å sjekke integriteten til mitokondriepreparater, noe som er grunnleggende under proteomiske studier av mitokondrie subcompartments.