Denne protokol giver os mulighed for at forstå, hvordan individuelle celletyper til stede i det menneskelige intestinale epitelrespons på virusinfektion. Vi præsenterer her tre uafhængige måder at så menneskelige tarmorganoider på for at løse, hvordan infektionsvejen kan påvirke, hvordan cellen reagerer. Vi fremhæver, hvordan man forbereder prøver til enkeltcellet RNA-sekventering i betragtning af de biosikkerhedsbestemmelser, der skal overholdes, når man arbejder med kategori 3-patogener.
Denne metode kan nemt tilpasses andre patogener og organoidkulturer. Den vigtigste overvejelse er at sikre, at dine organoid modeller er fuldt differentieret med den valgte såning metode og kan støtte virusinfektion. Før høst af de inficerede organoider, fjern enkeltcellegelperlerne fra minus 80 grader Celsius og varm dem til stuetemperatur.
Derudover skal du ekvilibrere RT-reagenset, reducere agent B og RT-enzymeT C til stuetemperatur og genbruge skabelonafbryderen oligo som beskrevet i producentens anvisninger. Dernæst for at indsamle 3D-organoider, der er inficeret med BSL-3-patogenet, skal du fjerne cellekulturpladen fra inkubatoren og placere den i cellekulturhætten. Derefter ved hjælp af en P1000 pipette, fjerne differentiering medier fra hver brønd af 24-brønd plade, tilføje 500 mikroliter af iskold PBS til hver brønd og inkubere ved stuetemperatur i tre minutter.
Dernæst for fuldt ud at forstyrre den ekstracellulære matrixopløsning, pipette op og ned 10 gange for at genbruge PBS, ekstracellulær matrix og organoider, derefter overføre de suspenderede organoider til et 15 milliliter konisk rør og læg rørene på is. Saml hver infektion tilstand i separate 15 milliliter koniske rør. Efter at have skiftet handsker skal du rengøre ydersiden af røret og fjerne røret fra cellekulturhætten.
Drej prøverne i fem minutter. Flyt røret tilbage i cellekulturhætten og fjern PBS, så du undgår resuspension af organoidens pellet fra bunden af røret. Dernæst genbruge pellet i en milliliter af dissociation enzym.
skift derefter handsker, rengør røret, og inkuber prøverne ved 37 grader Celsius i 30 minutter. Under inkubationen flyttes røret tilbage i cellekulturhætten hvert 10. minut og genbruger organoiderne ved at pipetter op og ned. For at afgøre, om organoiderne adskilles i enkelte celler, skal du placere 10 mikroliter af organoidaffjedringen i et engangsplastcelletællerdias ved hjælp af en P10-pipette og derefter forsegle prøveinputporten med klart tape.
Når du har skiftet handsker, skal du rengøre ydersiden af celletælleren og bruge et Brightfield-mikroskop, bekræfte, at der oprettes en enkelt celleaffjedring. Efter bekræftelse af enkelt celle suspension, stoppe fordøjelsen ved at tilføje en milliliter af DMEM F12 medier, der indeholder 10% FBS og pipette op og ned 10 gange. Skift derefter handskerne, rengør røret og drej prøven.
Efter centrifugering fjernes mediet, der indeholder dissociationsenzymet, forsigtigt for ikke at forstyrre cellepillen i bunden. Derefter genbruges de enkelte celler i et minimalt volumen af PBS, der indeholder 0,1%BSA. Når celleaffjedringen er passeret ind i et FACS-rør gennem et filter for at fjerne store klumper, skal du placere røret på is.
Dernæst til at bestemme antallet af celler pr mikroliter, tilføje 10 mikroliter af celle suspension til en engangs plast celle tælle kammer. Forsegl derefter prøveinputporten med klart tape, før prøven fjernes fra cellekulturhætten. Skift handsker, rengør celletællingskammeret, og tæl derefter antallet af celler ved hjælp af et Brightfield-mikroskop.
Dernæst, inde i cellekultur hætte, forberede en master blanding af RT reagens, skabelon switch oligo, reducerende agent B, og RT enzym C i en 1,5 milliliter rør som pr producentens anvisninger afhængigt af antallet af prøver i eksperimentet. For hver prøve, aliquot 33,4 mikroliter af master mix i en PCR rør, derefter tilføje celler og vand til master mix i henhold til målet celle nummer. Når du har skiftet handsker, skal du flytte enkeltcellecontrolleren ind i cellekulturhætten og forberede chippen.
Derefter skal du tilføje enkeltcellechippen i chipholderen og fylde de ubrugte baner med 50% glycerol. Tilsæt master mix, perler, og partitionering olie til de baner, der indeholder prøver pr producentens anvisninger og dække chippen med en pakning. Når chippen er indlæst i controlleren, skal du starte programmet.
Efter afslutningen af programmet, fjerne chippen og pakningen, Derefter ved hjælp af en multi-kanal pipette, overføre 100 mikroliter af emulsioner til at rense PCR rør. Sørg for, at hver emulsion har en ensartet hvid farve, der angiver, at der er sket en komplet emulsion. Når du har skiftet handsker og renset rørene, overføres PCR-rørene til en PCR-maskine og programmet startes.
I slutningen af PCR-kørslen vil de fleste indhyllede vira blive inaktiveret. De repræsentative Brightfield billeder på dag et, tre, fem og syv post-opdeling organoider er vist her. I gennemsnit opdeles organoiderne en gang om ugen, når centrene bliver mørke.
Ved at ændre medieforholdene, fjerne Wnt-3a og reducere R-spondin og noggin, kan den cellulære kompleksitet, der findes i den menneskelige tarm, efterlignes. Normalt kræver mobildifferentiering mod Paneth-celler, pokalceller og enterocytter fire dages differentieringsmedier. Analyse af enkeltcelle sekventeringsdata fra SARS-CoV-2 inficerede menneskelige kolon og ileum-afledte organoider viste, at kun en delpopulation af humane intestinale epitelceller støttede infektionen af SARS-CoV-2 efter 12 og 24 timer.
Analyse af medfødte immunresponser i SARS-CoV-2 inficerede kolon-afledte organoider viste, at SARS-CoV-2 induceret en pro-inflammatorisk signal kaskade i inficerede celler, mens ikke-inficerede tilskuerceller viste en interferon medieret immunrespons. Derudover viste encellet RNA-sekventering, at inficerede celler ikke var i stand til at fornemme interferoner på grund af virusmedieret blokering af stien. Organoiderne skal være veldifferentierede og sunde.
Dette kan styres ved at bestemme niveauet af celledifferentiering markører af qPCR før infektion. Hvis cellerne ikke er veldifferentierede, vil de ikke støtte virusinfektion og føre til uinformative resultater. Denne teknik giver os mulighed for at inficere slimhinde fra både den lysende og vævssiden.
Dette er meget vigtigt, da det giver os mulighed for at optrævle mekanismer, der anvendes af slimhindeoverflader til at tolerere et snavset miljø på den ene side og et sterilt på den anden.