이 프로토콜은 우리가 바이러스 성 감염에 인간 장 상피 반응에 존재하는 개별 세포 모형이 어떻게 이해하는 것을 허용합니다. 우리는 여기에서 감염의 경로가 세포가 어떻게 반응하는지 에 영향을 미칠 수 있는 방법을 다루기 위하여 인간 장 기관가노이드를 종자하는 3개의 독립적인 쪽을 제시합니다. 우리는 카테고리 3 병원균과 함께 작업 할 때 존중해야 할 생물 안전 규정을 고려하여 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 샘플을 준비하는 방법을 강조합니다.
이 방법은 다른 병원체 및 오르가노이드 배양에 쉽게 적응할 수 있습니다. 가장 중요한 고려 사항은 오르가노이드 모델이 선택한 종자 방법으로 완전히 차별화되고 바이러스 감염을 지원할 수 있는지 확인하는 것입니다. 감염된 오르가노이드를 수확하기 전에 단일 세포 젤 구슬을 영하 80도에서 제거하고 실온으로 데워집니다.
또한 RT 시약을 평형화하여 에이전트 B 및 RT 효소 C를 실온으로 줄이고 제조업체의 지침에 설명된 대로 템플릿 스위치 올리고를 다시 일시 중단합니다. 다음으로, BSL-3 병원체에 감염된 3D 오르가노이드를 수집하고, 인큐베이터로부터 세포 배양판을 제거하고 세포 배양 후드에 배치한다. 그런 다음 P1000 파이펫을 사용하여 24웰 플레이트의 각 웰에서 분화 매체를 제거하고, 500 마이크로리터의 얼음 차가운 PBS를 각 우물에 추가하고 실온에서 3 분 동안 배양합니다.
다음으로, 세포외 매트릭스 용액을 완전히 방해하기 위해, 파이펫을 10배 위아래로 기울여 PBS, 세포외 매트릭스 및 오르가노이드를 재중단한 다음, 재중단된 오르가노이드를 15밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 별도의 15 밀리리터 원판 튜브에서 각 감염 상태를 수집합니다. 장갑을 교체한 후 튜브 의 외부를 청소하고 세포 배양 후드에서 튜브를 제거합니다.
샘플을 5분간 회전시합니다. 튜브를 다시 세포 배양 후드로 옮기고 PBS를 제거하여 튜브 바닥에서 오르가노이드 펠릿의 재발을 피하십시오. 다음으로, 해리 효소의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 놓습니다.
그런 다음 장갑을 교체하고 튜브를 청소하고 샘플을 섭씨 37도에서 30 분 동안 배양합니다. 인큐베이션 하는 동안, 10 분마다 다시 세포 배양 후드로 튜브를 이동하고 위아래로 파이펫하여 오르가노이드를 다시 중단합니다. 오르가노이드가 단일 세포로 해리되는지 확인하려면 P10 파이펫을 사용하여 일회용 플라스틱 셀 카운터 슬라이드에 오가노이드 서스펜션 10 마이크로리터를 배치한 다음 명확한 테이프로 샘플 입력 포트를 밀봉하십시오.
장갑을 변경한 후, 셀 카운터의 외부를 청소하고 브라이트 필드 현미경을 사용하여 단일 세포 현탁액이 생성되는지 확인합니다. 단일 셀 서스펜션의 확인에 따라 10%의 FBS와 파이펫을 10배 위아래로 포함하는 DMEM F12 미디어의 1밀리리터를 추가하여 소화를 중지합니다. 그런 다음 장갑을 교체하고 튜브를 청소하고 샘플을 회전시합니다.
원심분리 후, 절단 효소를 함유한 매체를 주의 깊게 제거하고, 하단의 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 0.1%BSA를 포함하는 PBS의 최소 부피로 단일 셀을 다시 중단합니다. 큰 덩어리를 제거하기 위해 필터를 통해 FACS 튜브에 세포 서스펜션을 전달 한 후, 얼음에 튜브를 배치합니다.
다음으로, 마이크로리터당 세포 수를 결정하기 위해, 일회용 플라스틱 셀 카운팅 챔버에 셀 현탁액의 10 마이크로리터를 추가한다. 그런 다음 세포 배양 후드에서 샘플을 제거하기 전에 명확한 테이프로 샘플 입력 포트를 밀봉합니다. 장갑을 변경하고, 세포 카운팅 챔버를 청소한 다음, 브라이트필드 현미경을 사용하여 세포 수를 계산합니다.
다음으로, 세포 배양 후드 내부에서 실험시 샘플 수에 따라 제조업체의 지침에 따라 RT 시약, 템플릿 스위치 올리고, 감소제 B 및 RT 효소 C의 마스터 믹스를 제조한다. 각 샘플에 대해, PCR 튜브에 마스터 믹스의 33.4 마이크로리터를 알리쿼트한 다음, 대상 세포 수에 따라 마스터 믹스에 세포와 물을 추가한다. 장갑을 변경한 후 단일 셀 컨트롤러를 세포 배양 후드로 이동하고 칩을 준비합니다.
다음으로 단일 셀 칩을 칩 홀더에 넣고 사용하지 않은 차선을 50% 글리세롤로 채웁니다. 제조업체의 지침에 따라 샘플을 포함하는 레인에 마스터 믹스, 구슬 및 분할 오일을 추가하고 칩을 개스킷으로 덮습니다. 칩을 컨트롤러에 로드한 후 프로그램을 시작합니다.
프로그램이 완료되면 칩과 개스킷을 제거한 다음 멀티 채널 파이펫을 사용하여 에멀젼의 100 마이크로리터를 전송하여 PCR 튜브를 청소합니다. 각 에멀젼에 완전한 에멀젼이 발생했음을 나타내는 흰색색이 균일한지 확인합니다. 장갑을 교체하고 튜브를 청소한 후 PCR 튜브를 PCR 기계로 옮기고 프로그램을 시작합니다.
PCR 실행이 끝나면 대부분의 봉투에 둘러싸인 바이러스가 비활성화됩니다. 대표적인 브라이트필드 이미지는 1일, 3일, 5일, 7개의 분할 후 오르가노이드를 볼 수 있습니다. 평균적으로 오르가노이드는 중심이 어두워지면 일주일에 한 번 분할됩니다.
미디어 조건을 변경하여 Wnt-3a를 제거하고 R-spondin 및 noggin을 줄임으로써 인간 장 내에서 발견되는 세포 복잡성을 모방할 수 있습니다. 일반적으로, 창세포, 잔 세포 및 장내 세포를 향한 세포 분화는 4일간의 분화 매체를 필요로 한다. SARS-CoV-2 감염된 인간 결장 및 ileum 유래 오르가노이드로부터 의 단일 세포 염기서열 분석결과 인간 장 상피 세포의 하위 집단만이 12 시간 및 24 시간 후에 SARS-CoV-2의 감염을 지원한다는 것을 보여주었습니다.
SARS-CoV-2 감염된 대장 유래 오르가노이드에서 의 타고난 면역 반응의 분석은 SARS-CoV-2가 감염된 세포에서 프로 염증 신호 폭포를 유도한 반면 비감염방관 세포는 인터페론 중재 면역 반응을 보였다는 것을 보여주었다. 추가적으로, 단하나 세포 RNA 염기서열분석은 감염된 세포가 통로의 바이러스 매개 막힘으로 인해 인터페론을 감지할 수 없다는 것을 보여주었다. 오르가노이드는 잘 분화되고 건강해야합니다.
이는 감염 전에 qPCR에 의한 세포 분화 마커의 수준을 결정함으로써 조절될 수 있다. 세포가 잘 분화되지 않는 경우에, 그(것)들은 바이러스성 감염을 지원하지 않으며 유익한 결과로 이끌어 낼 것입니다. 이 기술은 우리가 발광과 조직 측 둘 다에서 점막을 감염시킬 수 있습니다.
이것은 우리가 한쪽에 더러운 환경을 용인하고 다른 쪽에 멸균 을 용인하기 위해 점막 표면에 의해 사용되는 메커니즘을 해명 할 수 있기 때문에 매우 중요합니다.
