Este protocolo nos permite comprender cómo los tipos de células individuales presentes en el epitelio intestinal humano responden a la infección viral. Aquí presentamos tres formas independientes de sembrar organoides intestinales humanos para abordar cómo la ruta de infección puede afectar la forma en que responde la célula. Destacamos cómo preparar muestras para la secuenciación de ARN unicelular teniendo en cuenta las regulaciones de bioseguridad que deben respetarse cuando se trabaja con patógenos de categoría 3.
Este método se puede adaptar fácilmente a otros patógenos y cultivos de organoides. La consideración más importante es asegurarse de que sus modelos de organoides estén completamente diferenciados con el método de siembra elegido y puedan apoyar la infección viral. Antes de cosechar los organoides infectados, retire las perlas de gel de una sola célula de menos 80 grados centígrados y caliéntelas a temperatura ambiente.
Además, equilibre el reactivo RT, el agente reductor B y la enzima RT C a temperatura ambiente y resuspenda el oligo del interruptor de plantilla como se describe en las instrucciones del fabricante. A continuación, para recolectar organoides 3D infectados con el patógeno BSL-3, retire la placa de cultivo celular de la incubadora y colóquela en la campana de cultivo celular. Luego, usando una pipeta P1000, retire el medio de diferenciación de cada pozo de la placa de 24 pocillos, agregue 500 microlitros de PBS helado a cada pozo e incube a temperatura ambiente durante tres minutos.
A continuación, para interrumpir completamente la solución de matriz extracelular, pipetee hacia arriba y hacia abajo 10 veces para resuspendir el PBS, la matriz extracelular y los organoides, luego transfiera los organoides resuspendidos a un tubo cónico de 15 mililitros y coloque los tubos en hielo. Recoja cada condición de infección en tubos cónicos separados de 15 mililitros. Después de cambiar los guantes, limpie el exterior del tubo y retire el tubo de la campana de cultivo celular.
Gire las muestras durante cinco minutos. Mueva el tubo de nuevo a la campana de cultivo celular y retire el PBS, evitando la resuspensión del gránulo del organoide desde la parte inferior del tubo. A continuación, resuspenda el pellet en un mililitro de enzima de disociación.
luego cambie los guantes, limpie el tubo e incube las muestras a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Durante la incubación, mueva el tubo de nuevo a la campana de cultivo celular cada 10 minutos y vuelva a suspender los organoides mediante la pipeteación hacia arriba y hacia abajo. Para determinar si los organoides están disociados en células individuales, coloque 10 microlitros de la suspensión organoide en un portaobjetos de celdas de plástico desechable con una pipeta P10, luego selle el puerto de entrada de muestra con cinta transparente.
Después de cambiar los guantes, limpie el exterior del contador celular y, con un microscopio Brightfield, confirme que se ha creado una suspensión de una sola célula. Después de la confirmación de la suspensión de una sola célula, detenga la digestión agregando un mililitro de medios DMEM F12 que contengan 10% FBS y pipeta hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Luego cambie los guantes, limpie el tubo y gire la muestra.
Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el medio que contiene la enzima de disociación, teniendo cuidado de no molestar la bolita celular en la parte inferior. Luego resuspenda las células individuales en un volumen mínimo de PBS que contenga 0.1% BSA. Después de pasar la suspensión celular a un tubo FACS a través de un filtro para eliminar grupos grandes, coloque el tubo sobre hielo.
A continuación, para determinar el número de células por microlitro, agregue 10 microlitros de la suspensión celular a una cámara de conteo de células de plástico desechable. A continuación, selle el puerto de entrada de la muestra con cinta transparente antes de extraer la muestra de la campana de cultivo celular. Cambie los guantes, limpie la cámara de conteo de células y luego cuente el número de células con un microscopio Brightfield.
A continuación, dentro de la campana de cultivo celular, prepare una mezcla maestra de reactivo RT, oligo de cambio de plantilla, agente reductor B y enzima RT C en un tubo de 1,5 mililitros según las instrucciones del fabricante dependiendo del número de muestras en el experimento. Para cada muestra, alícuota 33.4 microlitros de mezcla maestra en un tubo de PCR, luego agregue las células y el agua a la mezcla maestra de acuerdo con el número de celda objetivo. Después de cambiar los guantes, mueva el controlador de una sola célula a la campana de cultivo celular y prepare el chip.
A continuación, agregue el chip de una sola celda en el soporte del chip y llene los carriles no utilizados con 50% de glicerol. Agregue la mezcla maestra, las perlas y el aceite de partición a los carriles que contienen muestras según las instrucciones del fabricante y cubra el chip con una junta. Después de cargar el chip en el controlador, inicie el programa.
Al finalizar el programa, retire el chip y la junta, luego use una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros de las emulsiones para limpiar los tubos de PCR. Asegúrese de que cada emulsión tenga un color blanco uniforme que indique que se ha producido una emulsión completa. Después de cambiar los guantes y limpiar los tubos, transfiera los tubos de PCR a una máquina de PCR e inicie el programa.
Al final de la ejecución de PCR, la mayoría de los virus envueltos se inactivarán. Las imágenes representativas de Brightfield en los días uno, tres, cinco y siete organoides posteriores a la división se muestran aquí. En promedio, los organoides se dividen una vez a la semana cuando los centros se oscurecen.
Al cambiar las condiciones de los medios, eliminar Wnt-3a y reducir R-spondin y noggin, se puede imitar la complejidad celular que se encuentra dentro del intestino humano. Normalmente, la diferenciación celular hacia las células de Paneth, las células caliciformes y los enterocitos requiere cuatro días de medios de diferenciación. El análisis de los datos de secuenciación de células individuales de los organoides infectados por sars-CoV-2 del colon humano y derivados del íleon mostró que solo una subpoblación de células epiteliales intestinales humanas apoyó la infección por SARS-CoV-2 después de 12 y 24 horas.
El análisis de las respuestas inmunes innatas en organoides derivados del colon infectados por SARS-CoV-2 mostró que el SARS-CoV-2 indujo una cascada de señales proinflamatorias en las células infectadas, mientras que las células transeúntes no infectadas mostraron una respuesta inmune mediada por interferón. Además, la secuenciación de ARN de una sola célula mostró que las células infectadas no podían detectar interferones debido al bloqueo de la vía mediado por virus. Los organoides deben estar bien diferenciados y sanos.
Esto se puede controlar determinando el nivel de marcadores de diferenciación celular por qPCR antes de la infección. Si las células no están bien diferenciadas, no apoyarán la infección viral y conducirán a resultados poco informativos. Esta técnica nos permite infectar la mucosa tanto del lado luminal como del tejido.
Esto es muy clave ya que nos permite desentrañar los mecanismos utilizados por las superficies mucosas para tolerar un ambiente sucio por un lado y uno estéril por el otro.
