3D tumor spheroids har erstattet den konventionelle 2D monolayer teknik som guldstandard for in vitro kræft forskning. Disse modeller tillader samkultur af flere celletyper, som afspejler heterogeniteten af tumormikromiljøet og tillader udnyttelse af rumlige interaktioner. Fordele ved at bruge de hængende dråber metode til at generere 3D spheroids er manglen på celle-plast interaktion og den lethed at studere samspillet mellem tumorceller og ikke-tumorceller.
Denne teknik giver også en reproducerbar og omkostningseffektiv måde at modellere tumor-stromal interaktion. 3D tumoroider er værdifulde prækliniske modeller og bruges ofte som et lægemiddelscreeningsværktøj. Denne metode kan anvendes til at studere de farmakologiske virkninger af flere forbindelser på tumorvækst og det omgivende mikromiljø.
Processen med spheroid dannelse er brugervenlig og kræver konventionelle celle kultur lab udstyr. Spheroids kan afbildes ved hjælp af enhver bænk top omvendt lysmikroskop, og analysen af spheroid størrelse og form kan udføres ved hjælp af bredt tilgængelige online billedanalyse software. Til at begynde med skal du fjerne Huh7 og Hep3B HCC tumorcellelinjer og COS-7 og LX2 fibroblastcellelinjer fra deres opbevaringsstativ i flydende nitrogen og hurtigt optø dem.
Efter optøning fortyndes de optøede celler med to milliliter frisk kulturmedium. Centrifugere cellerne. Kassér supernatanten og genbrug cellepillen i en milliliter frisk varm kulturmedium.
Så frø cellerne i T75 celle kultur kolber og inkubere dem i en celle kultur inkubator, indtil cellerne når 60 til 70 &sammenløb. Til cellesamling skal du aspirere kulturmedierne og vaske cellerne tre gange med PBS. Derefter for at løsne klæbende celler fra bunden af kolberne, tilsæt to milliliter forvarmet trypsin og inkuberer ved 37 grader Celsius.
Efter fire minutter skal trypsinen inaktiveres ved at tilføje fire milliliter komplet kulturmedium og opsamle celleaffjedringen, derefter centrifugere cellerne og kassere supernatanten, før cellerne genudsendes i en milliliter frisk kulturmedie. Endelig tilføje yderligere tre milliliter af frisk kultur medium. For at tælle cellerne skal du forsigtigt hvirvler celleaffjedringen.
Derefter ved hjælp af en 10 mikroliter pipette, bland 10 mikroliter af celleaffjedringen med 10 mikroliter af trypan blå og forsigtigt pipette blandingen op og ned fire gange for at sikre fuldstændig farvning af den ydre celleoverflade med farvestoffet. Placer derefter en coverlip over hæmocytometertællingsområdet. Placer derefter pipettespidsen, der indeholder celleblandingen ved siden af kanten af dæksleren, og udtræk forsigtigt spidsens indhold i tællediaset.
Efter at have ventet i et par minutter for gyllen at bosætte sig, fastsætte hæmocytometeret på mikroskop fase og tælle cellerne overlappende toppen eller den rigtige afgørelse og samtidig undgå dem, der overlapper bunden eller venstre afgørelse. Endelig beregne det samlede antal celler ved hjælp af denne formel. Efter at have aspireret kulturmediet, vask LX2-cellerne tre gange med PBS.
Fjern cellerne ved hjælp af trypsin som påvist tidligere og centrifugere dem. Efter at have talt cellerne som tidligere demonstreret, frø en gange 10 til den sjette LX2 celler i 10 kubikcentimeter retter og inkubere ved 37 grader Celsius. Efter 48 timer, indsamle fibroblast-konditioneret medium og centrifuge at pellet eventuelle flydende celler.
Filter sterilisere det betingede medium ved hjælp af et 0,22 mikron filter fastgjort til en 20 milliliter sprøjte. Derefter aliquot medierne i to milliliter rør til opbevaring på minus 80 grader Celsius. Tilsæt 10 milliliter steril PBS til bunden af en 10 kubikcentimeter skål for at give fugtige forhold for spheroids.
Derefter suspendere 1,500 HuH7 HCC celler med 1,500 COS-7 pattedyr fibroblast celler i hængende dråber til at danne kugler. Vend låget på fadet for at gøre det muligt for medierne, herunder celleaffjedring, at hænge over et fugtigt miljø. Efter tre dage, for at tage billeder af spheroids, sætte skålen på scenen af en omvendt mikroskop og justere forstørrelsen til fem gange.
Åbn derefter mikroskopsoftwaren på den tilsluttede computer og juster dens fokus for at have et klart billede af hver spheroid. Brug derefter snapværktøjet på mikroskopsoftwaren til at erhverve billederne og gemme de erhvervede billeder. Tilsæt 10 milliliter steril PBS til bunden af en 10 kubikcentimeter skål.
Derefter suspendere 3,000 Hep3B HCC celler i de hængende dråber til at danne kugler og vende låget af fadet tillader dråber til at hænge over et fugtigt miljø i tre dage. Overfør derefter Hep3B-spheroiderne til 20 mikroliter af friske tilstandsmedier fra LX2-celler i hængende dråber. Vend derefter låget på skålen, hvor spheroiderne dannes, og fastgør låget på scenen af et let mikroskop.
Juster mikroskopets fine fokus for at gøre hver spheroid synlig som påvist tidligere. Når du har trykket på stempelknappen for forsigtigt at tømme luften fra mikropipetten, skal pipettespidsen indsættes i dråben, der indeholder den spheroid, der skal overføres. Kom meget tæt på spheroiden uden at røre den med spidsen.
Slip derefter forsigtigt trykket på stempelknappen for at tillade sug af spheroiden i mikropipettespidsen i to mikroliter af medier. Overfør derefter spheroiden til en ny dråbe hængende på en ny 10 kubikcentimeter skål. Tag billeder af spheroids på fem gange forstørrelse ved hjælp af en omvendt mikroskop fra dagen for overførsel indtil dag syv af kultur i LX2 konditioneret medier.
For at analysere billederne af de voksende spheroids skal du åbne hvert spheroid-billede i en billedanalysesoftware og bruge frihåndsvalgværktøjet til at skitsere hver spheroid. Vælg derefter sætmåling efterfulgt af område på rullelisteknappen analyse efterfulgt af område, og tryk på OK. Derefter skal du manuelt tegne en cirkel omkring hver spheroid, og når kuglen er cirklet, skal du trykke på Kontrol M for at give programmet mulighed for at beregne spheroidområdet i pixel. Konverter derefter spheroidens område til et volumen ved hjælp af denne formel.
Endelig beregne ændringen i spheroid volumen i forhold til dens volumen på den første dag i billedoptagelse. Under optimering af celletætheden for spheroid dannelse gav højere såningstætheder på 12, 000 og 6.000 celler spheroider med en asymmetrisk form, mens en såningstæthed på 3.000 celler gav en perfekt afrundet 3D-spheroid. Således blev 3.000 celletæthedsspheroider tilpasset til yderligere eksperimenter.
Langsgående vurdering af den proliferative virkning fra co-culturing tumor og fibroblast cellelinjer viste, at fra dag fire og fremefter, heterotypic spheroids voksede i en ideel runde-lignende form i forhold til homotypic spheroids. Heterotypic spheroids oprindeligt viste en hurtig vækstfase starter fra dag fire til dag syv, efterfulgt af en langsommere fase på dag otte. Spheroid volumen derefter faldt på dag ni og 10, muligvis afspejler udtømning af næringsstoffer eller en hypoxisk kerne og celledød.
I modsætning hertil udviste de homotypic spheroids en relativt statisk vækstkurve indtil dag fem, efterfulgt af en gradvis stigning i deres vækstkurver fra dag seks og fremefter. Den højere vækstrate af heterotypic spheroids tyder på, at den direkte kontakt mellem tumor og fibroblaster øger størrelsen af tumorspheroids. Når tre dage gamle homotypic Hep3B spheroids blev dyrket i friske medier, cellerne dannede perfekt afrundede spheroids efter tre dage og viste fortsat spredning indtil dag syv.
Vækstraten blev forbedret, når spheroids blev opretholdt i LX2 konditionerede medier, hvilket tyder på en fibroblast-drevet spredning af tumorspheroider. Det er afgørende at sikre, at den sterile BBS tilsættes til bunden af opvasken for at opretholde passende fugtig tilstand til spheroid dannelse. Vær også forsigtig, mens du inverterer låget, så spheroiderne og dråberne ikke forstyrres.
3D tumorspheroider kan fastgøres eller fryses og opbevares til fremtidige anvendelser såsom immunkemi eller immunfluorescence samt RNA-ekstraktion til transskriptom analyse. Heterotypic spheroids med præ-mærkede celler kan afbildes og spores for at give indsigt i celle-celle interaktioner inden for tumor mikromiljø.
