Hybrid De Novo Genom Assembly til generering af komplette genomer af urinbakterier ved hjælp af kort- og langlæste sekventeringsteknologier

Denne omfattende protokol instruerer, hvordan man genererer tætte genomer af forskellige urinbakterier og gør det muligt for læsere uden kodningserfaring at implementere terminalbaseret genomsamling og analyserørledninger. Komplette genomsamlinger gør det muligt at opdage gener, der bidrager til kolonisering og virulens blandt commensale og uropatogene bakterier. Nære genomer giver indsigt i genomarkitektur og mobile genetiske elementer.

Hybridgenomassembedmetoden kan anvendes på alle kultérbare bakterier, der er isoleret fra andre anatomiske steder eller miljømæssige nicher for at give lignende indsigt i genomindhold og arkitektur. Følg protokollen og producentens guide for at forberede en dobbeltstrenget DNA-pool og fortsætte med at rydde op ved at tilføje 2,5 gange mængden af paramagnetiske perler til DNA-poolen, og derefter forsigtigt svirp røret for at blande indholdet. Drej kortvarigt prøven ved 2.000 gange G, og prøven anbringes på en rotator i fem minutter ved stuetemperatur, hvorefter perlerne pellet på magneten.

Vask derefter pellet to gange med 250 mikroliter frisklavet 70% ethanol i nucleasefrit vand uden at forstyrre pellet. Lad røret stå på magneten under vask. Aspirat ethanol efter hver vask, derefter kortvarigt spinde ned prøven på 2.000 gange G, før du returnerer den til magneten.

Pipette off resterende ethanol og lad pellet tørre i 30 sekunder. Når den er tørret, skal du genbruge pelleten i 60 til 70 mikroliter nukleasefrit vand og inkubere prøven ved stuetemperatur i to minutter og derefter pille prøven på magneten, indtil eluten er klar. Elute overføres til et rent 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.

Kvantificer den koncentrerede dobbeltstrengede DNA-pulje ved hjælp af et fluorometer, og forbered derefter en aliquot på 700 nanogram af prøven i 65 mikroliter endelige volumen for at gå videre til adapter ligation trin og bevare resten af puljen på fire grader Celsius for en anden kørsel efter den første kørsel er færdig. Fortsæt med adapter ligation i henhold til producentens anvisninger. Hvis du vil fortsætte med sekventering, skal du blande primingbuffere og prime flowcellen.

Forbered DNA-biblioteksløsningen, og læg prøven dropwise på lasteporten. Start rækkefølgen. Åbn driftssoftwaren til rækkefølge, og klik på startknappen, og skriv derefter et navn til eksperimentet.

Gå til at fortsætte med at kit udvælgelse for at vælge den relevante bibliotek prep kit og stregkode ekspansion pack bruges og derefter klikke på fortsætte med at køre muligheder. Hvis du planlægger at forberede et tilstrækkeligt bibliotek til en anden kørsel, skal du justere kørelængden fra standard 72 timer til 48 timer og fortsætte med at basere opkald. Kontroller indstillingen basecalling i config fast basecalling.

Indstil stregkode til aktiveret, så output FASTQ vil blive trimmet fra stregkode sekvenser og af-multiplexed i separate mapper baseret på stregkode. Klik videre fortsætte med at output. Vælg derefter, hvor outputsekvenseringsdata skal gemmes.

Forvent mellem 30 og 50 gigabyte data, hvis der kun gemmes FASTQ-output og mere end 500 gigabyte data, hvis fast5-output gemmes. Hvis du planlægger at fortsætte med manuel filtrering efter rækkefølge, skal du fjerne markeringen af filtreringsindstillingen Qscore syv i læselængde ufiltreret. Ellers skal du lade indstillingen være markeret.

Gå for at fortsætte med at køre installationsfanen for at gennemse alle indstillingerne. Hvis indstillingerne er korrekte, skal du klikke på startknappen. Ellers skal du klikke på tilbage for at foretage de nødvendige justeringer.

Opret nye mapper for hver stregkode, der bruges i kørslen, i den lange læsermappe. Kopier alle fastq-filer, der svarer til hver stregkode, til den relevante mappe. Kombiner alle fastq-filer for hver stregkode fra hver kørsel.

Når filerne er kombineret, skal du åbne terminalen og navigere til stregkodemapperne i den lange læsermappe ved hjælp af cd-kommandoen. Hvis du vil sammenkæde alle fastq-filer pr. stregkode til en enkelt fastq-fil, skal du udføre kommandoen og gentage proceduren for hver stregkode. Brug NanoStat til at vurdere prøvens læsekvalitet ved at udføre kommandoen og derefter registrere resultaterne ved at kopiere outputtet til en tekst- eller Word-fil til fremtidig reference.

Når resultaterne er gemt, skal du bruge NanoFilt til at filtrere MinION-læsninger, kassere læsninger med Q mindre end syv og længden mindre end 200 ved at udføre kommandoen. Kør NanoStat med kommandoen på den genererede trimmede fil. Registrer resultaterne ved at kopiere outputtet til en tekst- eller Word-fil, og sammenlign med de tidligere resultater for at sikre, at filtreringen lykkedes.

Gentag trinnene for hver stregkode, der bruges i sekvenseringskørslen. Til generering af hybridgenomassembly skal du organisere de kortlæste filer og lange læsefiler i en enkelt mappe med navnet trimmed_reads. Så mappen indeholder en tidligere genereret fastq.

gz fil til trimmet lange læser og to fastq. gz filer som R1 og R2 for trimmet korte læser. Gå til den mappe, trimmed_reads, der gemmer læsefilerne ved hjælp af cd-kommandoen i terminalen.

Når du er i den rigtige mappe, skal du zip de to kortlæste filer, der skal gemmes i fastq. gz-format ved at udføre kommandoen. Gentag trinnet for både R1 og R2. Sørg for, at alle de læste filer er i fastq.

gz format og kontrollere, at alle filerne matcher den samme isolere. Start hybridassemblyen ved hjælp af Unicycler ved at køre kommandoen. Når kørslen er fuldført, skal du gennemse unicycleren.

logfil for at sikre ingen fejl. Registrer antallet, størrelsen og den fuldstændige eller ufuldstændige status for den genererede kontekst. Hvis der er identificeret ufuldstændige kontekster i Unicycler-logfilen, skal du køre Unicycler igen med fed skrift ved at føje flaget til kommandoen.

Åbn Bandage og klik på filen, vælg derefter indlæs graf og vælg samlingen. gfa-fil, der tidligere blev gemt i unicycler_output_directory genereret af Unicycler. Når filen er indlæst, skal du klikke på knappen tegngraf på venstre værktøjslinje og vurdere, om assemblyen er fuldført, ved at undersøge, hvordan kontigerne er tilsluttet og organiseret.

Naviger i terminalen til den mappe, der gemmer Outputtet Unicycler ved hjælp af cd-kommandoen. Kør derefter quast-protokollen ved at udføre kommandoen. Gennemse de rapporter, der genereres af quast i outputmappen quast_output_directory.

Naviger i terminalen til den mappe, der gemmer Outputtet Unicycler ved hjælp af cd-kommandoen, og kør derefter prokka ved at udføre kommandoen. Gennemse anmærkningerne ved at åbne tsv-tabellen og ved at uploade den gff-fil, der genereres til sekvensanalysesoftwaren. Visualiser og analyser anmærkningerne i softwaren.

I de repræsentative gelbilleder afbildes genomisk DNA eller gDNA-ekstraktionsresultater. Vellykket udvinding og adskillelse af intakt gDNA kan observeres. Mislykket udvinding, der viser fragmenteret gDNA- og RNA-forurening, er også afbildet.

Genomsamlingsgraferne af bakterier blev genereret af Unicycler hybrid de novo assembly og visualiseret af Bandage. Det komplette genom af Klebsiella oxytoca KoPF10 demonstrerede et enkelt lukket kromosom, og det komplette genom af Klebsiella pneumoniae KpPF25 bestod af et lukket kromosom og fem lukkede plasmider. Det ufuldstændige kromosom af Klebsiella pneumoniae KpPF46 bestod af to sammenkoblede snoet.

Samlingen kort genereret af Geneious Prime for den komplette genom af Klebsiella oxytoca KoPF10 og Klebsiella pneumoniae KpPF25 viser kommenterede gener betegnet med farvede pile langs plasmid rygraden. For at sikre, at indlæsningen af flowceller lykkes, skal du filtrere lange læsninger ved hjælp af de anbefalede indstillinger og sikre, at alle filer er i fastq. gz format.

Kør den korrekte Unicycler-kommando ved hjælp af filer, der tilhører det samme eksempel.