लघु और लंबे समय से पढ़ने वाली अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों का उपयोग करके मूत्र बैक्टीरिया के पूर्ण जीनोम की पीढ़ी के लिए हाइब्रिड डी नोवो जीनोम असेंबली

यह व्यापक प्रोटोकॉल निर्देश देता है कि विविध मूत्र बैक्टीरिया के करीबी जीनोम कैसे उत्पन्न किए जाएं और टर्मिनल-आधारित जीनोम असेंबली और विश्लेषण पाइपलाइनों को सफलतापूर्वक लागू करने के लिए कोई कोडिंग अनुभव वाले पाठकों को सक्षम बनाता है। पूर्ण जीनोम विधानसभाओं संमेंसल और यूरोपैथोजेनिक बैक्टीरिया के बीच उपनिवेशीकरण और उग्रता के लिए योगदान जीन की खोज सक्षम । बंद जीनोम जीनोम वास्तुकला और मोबाइल आनुवंशिक तत्वों में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

हाइब्रिड जीनोम असेंबली विधि को जीनोम सामग्री और वास्तुकला में समान अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए अन्य शारीरिक साइटों या पर्यावरणीय निकस से अलग किसी भी कृषि योग्य बैक्टीरिया पर लागू किया जा सकता है। एक डबल फंसे डीएनए पूल तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल और निर्माता गाइड का पालन करें और डीएनए पूल में पैरामैग्नेटिक मोतियों की मात्रा 2.5 गुना जोड़कर साफ करने के लिए आगे बढ़ें, और फिर सामग्री को मिलाने के लिए धीरे-धीरे ट्यूब को फ्लिकिंग करें। संक्षेप में 2, 000 बार जी पर नमूना नीचे स्पिन और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए एक रोटेटर पर नमूना जगह है, तो चुंबक पर मोती गोली ।

इसके बाद, गोली को परेशान किए बिना नाभिक मुक्त पानी में ताजा तैयार 70% इथेनॉल के 250 माइक्रोलीटर के साथ दो बार गोली धोएं। वॉश के दौरान ट्यूब को चुंबक पर छोड़ दें। प्रत्येक धोने के बाद इथेनॉल को एस्पिरेट करें, फिर इसे चुंबक में लौटने से पहले 2, 000 बार जी पर नमूना संक्षेप में स्पिन करें।

अवशिष्ट इथेनॉल से पिपेट करें और गोली को 30 सेकंड के लिए सूखने दें। एक बार सूख जाने के बाद, न्यूक्लियस-फ्री पानी के 60 से 70 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से रखें और दो मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूना को इनक्यूबेट करें, फिर एल्यूट स्पष्ट होने तक चुंबक पर नमूना लें। एल्यूट को एक साफ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।

एक फ्लोरोमीटर का उपयोग कर केंद्रित डबल फंसे डीएनए पूल की मात्रा, तो ६५ माइक्रोलीटर अंतिम मात्रा में नमूने के ७०० नैनोग्राम का एक aliquot तैयार करने के लिए एडाप्टर ligation कदम के लिए आगे बढ़ना और पहले रन समाप्त होने के बाद एक दूसरे रन के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर पूल के शेष बनाए रखने । निर्माता निर्देशों के अनुसार एडाप्टर लिगेशन जारी रखें। अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ने के लिए, प्राइमिंग बफ़र्स और प्राइम फ्लो सेल को मिलाएं।

डीएनए लाइब्रेरी समाधान तैयार करें और लोडिंग पोर्ट पर नमूना ड्रॉपवाइज लोड करें। अनुक्रमण रन शुरू करें। अनुक्रमण के लिए ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर खोलें और स्टार्ट बटन पर क्लिक करें, फिर प्रयोग के लिए एक नाम इनपुट करें।

उपयुक्त पुस्तकालय तैयारी किट और बारकोड विस्तार पैक का चयन करने के लिए किट चयन जारी रखने के लिए जाएं और फिर विकल्पों को चलाने के लिए जारी रखने पर क्लिक करें। यदि एक दूसरे रन के लिए पर्याप्त पुस्तकालय तैयार करने की योजना बना रहे हैं, तो रन की लंबाई को डिफ़ॉल्ट 72 घंटे से 48 घंटे तक समायोजित करें और बेसकॉलिंग जारी रखें। कॉन्फिग फास्ट बेसकॉलिंग में बेसकॉलिंग का ऑप्शन चेक करें।

बारकोडिंग को सक्षम करने के लिए सेट करें ताकि आउटपुट FASTQ को बारकोड दृश्यों से छंटनी की जाएगी और बारकोड के आधार पर अलग-अलग निर्देशिकाओं में डी-मल्टीप्लेक्स किया जाएगा। आउटपुट जारी रखने पर क्लिक करें। इसके बाद, आउटपुट अनुक्रमण डेटा को कहां से बचाना है, चुनें।

यदि केवल FASTQ आउटपुट और 500 गीगाबाइट से अधिक डेटा की बचत करें, तो लगभग 30 से 50 गीगाबाइट डेटा की अपेक्षा करें। यदि अनुक्रमण के बाद मैनुअल फ़िल्टरिंग के साथ आगे बढ़ने की योजना बना रहे हैं, तो रीड लेंथ अनफ़िल्टर्ड में फ़िल्टरिंग विकल्प Qscore सात को अनचेक करें। अन्यथा, विकल्प की जांच छोड़ दें।

सभी सेटिंग्स की समीक्षा करने के लिए सेटअप टैब चलाना जारी रखें। अगर सेटिंग्स सही हैं तो स्टार्ट बटन पर क्लिक करें। अन्यथा, किसी भी आवश्यक समायोजन करने के लिए वापस पर क्लिक करें।

लंबे समय में निर्देशिका पढ़ता है, चलाने में इस्तेमाल प्रत्येक बारकोड के लिए नई निर्देशिका बनाएं । उपयुक्त फ़ोल्डर में प्रत्येक बारकोड के अनुरूप सभी फास्टक्यू फ़ाइलों को कॉपी करें। हर रन से प्रत्येक बारकोड के लिए सभी fastq फ़ाइलों को मिलाएं।

एक बार फ़ाइलों को संयुक्त कर रहे हैं, टर्मिनल खोलने के लिए और लंबे समय के भीतर बारकोड निर्देशिका के लिए नेविगेट सीडी कमान का उपयोग कर निर्देशिका पढ़ता है । एक ही फास्टक्यू फ़ाइल में प्रति बारकोड सभी फास्टक्यू फ़ाइलों को संक्षिप्त करने के लिए, कमांड को निष्पादित करें और प्रत्येक बारकोड के लिए प्रक्रिया दोहराएं। कमांड को निष्पादित करके नमूने की पठन गुणवत्ता का आकलन करने के लिए नैनोस्टैट का उपयोग करें और फिर भविष्य के संदर्भ के लिए आउटपुट को टेक्स्ट या वर्ड फाइल में कॉपी करके परिणाम रिकॉर्ड करें।

परिणाम सहेजे जाने के बाद, मिनियन को फ़िल्टर करने के लिए नैनोफिल्ट का उपयोग करें, कमांड को निष्पादित करके सात से कम सात और लंबाई से कम 200 के साथ पढ़ता है। उत्पन्न छंटनी की गई फ़ाइल पर, कमांड के साथ नैनोस्टैट चलाएं। आउटपुट को टेक्स्ट या वर्ड फाइल में कॉपी करके परिणामों को रिकॉर्ड करें और यह सुनिश्चित करने के लिए कि फ़िल्टरिंग सफल रही है, पिछले परिणामों की तुलना करें।

अनुक्रमण रन में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक बारकोड के लिए चरणों को दोहराएं। हाइब्रिड जीनोम असेंबली उत्पन्न करने के लिए, कम पढ़ी गई फ़ाइलों और लंबे समय तक पढ़ी जाने वाली फाइलों को trimmed_reads नाम की एक निर्देशिका में व्यवस्थित करें। तो निर्देशिका में पहले से उत्पन्न फास्टक्यू होता है।

छंटनी की लंबी पढ़ता है और दो fastq के लिए जीजेड फ़ाइल। छंटनी की गई छोटी बातों के लिए R1 और R2 के रूप में जीजेड फाइलें। निर्देशिका trimmed_reads पर नेविगेट करें जो टर्मिनल में सीडी कमांड का उपयोग करके पढ़ी गई फ़ाइलों को संग्रहित करता है।

एक बार सही निर्देशिका में, फास्टक्यू में स्टोर करने के लिए दो छोटी पढ़ी गई फाइलों को ज़िप करें। आदेश को निष्पादित करके जीजेड प्रारूप। R1 और R2 दोनों के लिए कदम दोहराएं। सुनिश्चित करें कि सभी पढ़ी गई फाइलें फास्टक्यू में हैं।

जीजेड प्रारूप और सत्यापित करें कि सभी फाइलें एक ही अलग से मेल खाती हैं। कमांड चलाकर यूनिसाइकिलर का उपयोग करके हाइब्रिड असेंबली शुरू करें। जब रन पूरा हो जाए, तो यूनिसाइकिलर की समीक्षा करें।

कोई त्रुटि सुनिश्चित करने के लिए लॉग फाइल करें। उत्पन्न संदर्भ की संख्या, आकार और पूर्ण या अधूरी स्थिति रिकॉर्ड करें। यदि यूनिसाइकिल लॉग में अधूरे संदर्भों की पहचान की जाती है, तो कमांड में ध्वज जोड़कर यूनिसाइकिलर को बोल्ड मोड में फिर से चलाएं।

पट्टी खोलें और फ़ाइल पर क्लिक करें, फिर लोड ग्राफ चुनें और असेंबली का चयन करें। जीएफए फाइल जो पहले यूनिसाइकिलर द्वारा उत्पन्न unicycler_output_directory को सहेजी गई थी। एक बार फाइल लोड होने के बाद, बाएं हाथ के टूलबार पर ड्रॉ ग्राफ बटन पर क्लिक करें और मूल्यांकन करें कि क्या असेंबली पूरी हो गई है कि कॉन्टिग्स कैसे जुड़े और व्यवस्थित होते हैं।

टर्मिनल के भीतर फ़ोल्डर पर नेविगेट करें जो सीडी कमांड का उपयोग करके यूनिसाइकिलर आउटपुट को स्टोर करता है। फिर आदेश को निष्पादित करके क्वास्ट प्रोटोकॉल चलाएं। आउटपुट डायरेक्टरी quast_output_directory में क्वास्ट द्वारा उत्पन्न रिपोर्टों की समीक्षा करें।

टर्मिनल के भीतर फोल्डर पर नेविगेट करें जो सीडी कमांड का उपयोग करके यूनिसाइकिलर आउटपुट को स्टोर करता है, फिर कमांड को निष्पादित करके प्रोक्का चलाता है। टीएसवी टेबल खोलकर और सीक्वेंस एनालिसिस सॉफ्टवेयर में जनरेट की गई ग् एफएफ फाइल अपलोड करके एनोटेशन की समीक्षा करें। सॉफ्टवेयर में एनोटेशन की कल्पना और विश्लेषण करें।

प्रतिनिधि जेल छवियों में, जीनोमिक डीएनए या gDNA निष्कर्षण परिणामों को चित्रित किया गया है। सफल निष्कर्षण और बरकरार gDNA के अलगाव देखा जा सकता है। खंडित gDNA और आरएनए संदूषण दिखा असफल निष्कर्षण भी चित्रित कर रहे हैं ।

बैक्टीरिया के जीनोम असेंबली रेखांकन यूनिसाइकिलर हाइब्रिड डी नोवो असेंबली द्वारा उत्पन्न किए गए थे और पट्टी द्वारा कल्पना की गई थी। क्लेबसिएला ऑक्सीटोका KoPF10 के पूर्ण जीनोम ने एक बंद गुणसूत्र का प्रदर्शन किया और क्लेबसिएला निमोनिया केपीपीएफ25 के पूर्ण जीनोम में एक बंद गुणसूत्र और पांच बंद प्लाज्मिड शामिल थे। क्लेबसिएला निमोनिया केपीपीएफ46 के अधूरे गुणसूत्र में दो परस्पर contigs शामिल थे।

क्लेबसिएला ऑक्सीटोका KoPF10 और Klebsiella निमोनिया KpPF25 के पूर्ण जीनोम के लिए जेनियस प्राइम द्वारा उत्पन्न असेंबली नक्शे प्लाज्मिड बैकबोन के साथ रंगीन तीर द्वारा दर्शाए गए एनोटेटेड जीन दिखाते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि फ्लो सेल लोडिंग सफल हो, अनुशंसित सेटिंग्स का उपयोग करके लंबे समय तक पढ़ता है और यह सुनिश्चित करता है कि सभी फाइलें फास्टक्यू में हैं। जीजेड प्रारूप।

एक ही नमूने से संबंधित फ़ाइलों का उपयोग कर सही यूनिसाइकिलर कमांड चलाएं।