Montagem híbrida de genoma de Novo para a geração de genomas completos de bactérias urinárias usando tecnologias de sequenciamento de leitura curta e longa

Este protocolo abrangente instrui como gerar genomas próximos de diversas bactérias urinárias e permite que os leitores sem experiência de codificação implementem com sucesso os dutos de montagem e análise de genomas baseados em terminais. Conjuntos completos de genomas permitem a descoberta de genes que contribuem para a colonização e virulência entre bactérias commensais e uropatogênicas. Genomas próximos fornecem informações sobre a arquitetura do genoma e elementos genéticos móveis.

O método de montagem do genoma híbrido pode ser aplicado a qualquer bactéria culturalmente isolada de outros locais anatômicos ou nichos ambientais para fornecer insights semelhantes sobre o conteúdo e a arquitetura do genoma. Siga o protocolo e o guia do fabricante para preparar uma piscina de DNA de dois fios e proceda à limpeza adicionando 2,5 vezes o volume de contas paramagnéticas à piscina de DNA e, em seguida, suavemente movendo o tubo para misturar o conteúdo. Gire brevemente a amostra a 2.000 vezes G e coloque a amostra em um rotador por cinco minutos à temperatura ambiente, em seguida, pique as contas no ímã.

Em seguida, lave a pelota duas vezes com 250 microlitadores de 70% de etanol recém-preparado em água sem nuclease sem perturbar a pelota. Deixe o tubo no ímã durante as lavagens. Aspirar etanol após cada lavagem, em seguida, rapidamente girar a amostra a 2.000 vezes G antes de devolvê-lo ao ímã.

Pipeta fora etanol residual e deixe a pelota secar por 30 segundos. Uma vez seco, resuspenque a pelota em 60 a 70 microlitadores de água sem nuclease e incubar a amostra em temperatura ambiente por dois minutos, em seguida, pelota a amostra no ímã até que o elto esteja claro. Transfira o elto para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro limpo.

Quantifique a piscina de DNA concentrada de dois fios usando um fluorômetro, em seguida, prepare uma alíquota de 700 nanogramas da amostra em 65 microliter volume final para prosseguir para a etapa de ligadura adaptadora e manter o restante da piscina em quatro graus Celsius para uma segunda corrida após a primeira corrida terminar. Continue com a ligadura do adaptador de acordo com as instruções do fabricante. Para prosseguir com o sequenciamento, misture os buffers de escoramento e prime a célula de fluxo.

Prepare a solução da biblioteca de DNA e carregue a amostra em gota para a porta de carregamento. Inicie a corrida de sequenciamento. Abra o software operacional para sequenciar e clique no botão iniciar e, em seguida, insira um nome para o experimento.

Vá continuar a escolher o kit de preparação da biblioteca apropriado e o pacote de expansão de código de barras usado e, em seguida, clique em continuar a executar opções. Se planeja preparar uma biblioteca suficiente para uma segunda corrida, ajuste o comprimento de execução de 72 horas a 48 horas padrão e pressione continue a fazer a chamada base. Verifique a opção de chamada base em configuração rápida de base.

Defina a codificação de barras para habilitar para que a saída FASTQ seja aparada das sequências de código de barras e des multiplexada em diretórios separados com base em código de barras. Clique em continuar a sair. Em seguida, escolha onde salvar dados de sequenciamento de saída.

Espere aproximadamente 30 a 50 gigabytes de dados se apenas salvar a saída FASTQ e mais de 500 gigabytes de dados se salvar a saída FAST5. Se o planejamento de prosseguir com a filtragem manual após o sequenciamento, desmarque a opção de filtragem Qscore sete no comprimento de leitura sem filtro. Caso contrário, deixe a opção verificada.

Vá continuar a executar a guia de configuração para revisar todas as configurações. Se as configurações estiverem corretas, clique no botão iniciar. Em caso de dúvida, clique em volta para fazer os ajustes necessários.

No diretório de leituras longas, crie novos diretórios para cada código de barras usado na corrida. Copie todos os arquivos fastq que correspondem a cada código de barras na pasta apropriada. Combine todos os arquivos fastq para cada código de barras de cada execução.

Uma vez que os arquivos são combinados, abra o terminal e navegue até os diretórios de código de barras dentro do diretório de leituras longas usando o comando cd. Para concatenar todos os arquivos fastq por código de barras em um único arquivo fastq, execute o comando e repita o procedimento para cada código de barras. Use o NanoStat para avaliar a qualidade de leitura da amostra executando o comando e, em seguida, registos, copiando a saída em um texto ou arquivo do Word para referência futura.

Depois que os resultados forem salvos, use NanoFilt para filtrar leituras minion, descartando leituras com Q inferior a sete e comprimento inferior a 200 executando o comando. No arquivo aparado gerado, execute o NanoStat com o comando. Registre os resultados copiando a saída em um arquivo de texto ou Word e compare com os resultados anteriores para garantir que a filtragem tenha sido bem sucedida.

Repita as etapas de cada código de barras usado na execução de sequenciamento. Para gerar montagem de genoma híbrido, organize os arquivos de leitura curta e arquivos de leitura longa em um único diretório chamado trimmed_reads. Assim, o diretório contém um fastq gerado anteriormente.

gz arquivo para leituras longas aparadas e dois fastq. gz arquivos como R1 e R2 para leituras curtas aparadas. Navegue até o diretório trimmed_reads que armazena os arquivos de leitura usando o comando cd no terminal.

Uma vez no diretório correto, feche os dois arquivos de leitura curta para armazenar no fastq. formato gz executando o comando. Repita o passo tanto para R1 quanto para R2. Certifique-se de que todos os arquivos de leitura estão no fastq.

formato gz e verifique se todos os arquivos correspondem ao mesmo isolado. Inicie o conjunto híbrido usando o Unicycler executando o comando. Quando a corrida estiver concluída, revise o monociclador.

arquivo de registro para garantir que não haja erros. Regisso número, tamanho e status completo ou incompleto do contexto gerado. Se contextos incompletos forem identificados no registro Unicycler, reloja o Unicycler no modo em negrito adicionando o sinalizador ao comando.

Abra o Curativo e clique no arquivo, em seguida, escolha o gráfico de carga e selecione o conjunto. arquivo gfa que foi salvo anteriormente para o unicycler_output_directory gerado pelo Unicycler. Uma vez que o arquivo esteja carregado, clique no botão de gráfico de desenho na barra de ferramentas à esquerda e avalie se o conjunto está completo examinando como os contigs estão conectados e organizados.

Navegue dentro do terminal até a pasta que armazena a saída Docicr usando o comando cd. Em seguida, execute o protocolo quast executando o comando. Revise os relatórios gerados pelo quast no diretório de saída quast_output_directory.

Navegue dentro do terminal até a pasta que armazena a saída do Unicycler usando o comando cd e execute prokka executando o comando. Revise as anotações abrindo a tabela tsv e carregando o arquivo gff gerado no software de análise de sequência. Visualize e analise as anotações no software.

Nas imagens representativas do gel, são retratados resultados genômicos de DNA ou extração de gDNA. Pode-se observar a extração e separação bem-sucedida de gDNA intacta. Extração mal sucedida mostrando contaminação fragmentada de GDNA e RNA também são retratadas.

Os gráficos de montagem do genoma das bactérias foram gerados pelo Conjunto Híbrido de Novo Unicycler e visualizados pela Bandge. O genoma completo de Klebsiella oxytoca KoPF10 demonstrou um único cromossomo fechado e o genoma completo de Klebsiella pneumoniae KpPF25 consistia de um cromossomo fechado e cinco plasmídeos fechados. O cromossomo incompleto de Klebsiella pneumoniae KpPF46 consistia de dois contigs interconectados.

Os mapas de montagem gerados por Geneious Prime para o genoma completo de Klebsiella oxytoca KoPF10 e Klebsiella pneumoniae KpPF25 mostrando genes anotados denotados por setas coloridas ao longo de espinhas plasmidas. Para garantir que o carregamento da célula de fluxo seja bem sucedido, filtrar leituras longas usando as configurações recomendadas e garantir que todos os arquivos estejam no fastq. formato gz.

Execute o comando Unicycler correto usando arquivos pertencentes à mesma amostra.