Name: analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00
Duration: 11 min 32 s
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我们感谢彭宁顿生物医学研究中心比较生物学核心工作人员的动物护理。这项研究得到了美国国立卫生研究院拨款U54GM104940（JPK）和KL2TR003097（LAG）的部分支持。所有涉及动物的实验和程序均由彭宁顿生物医学研究中心机构动物护理和使用委员会批准。

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作者与这项工作没有利益冲突。

评估癌症中线粒体呼吸的方法在很大程度上仅限于体外模型13，14，15，16。使用化学通透性6，7，17测量肿瘤中的线粒体呼吸已经取得了一些成功，但是没有统一的，金标准的方法可以普遍应用并跨肿瘤类型进行比较。此外，缺乏一致的数据分析和报告限制了数据的可推广性和可重复性。本文概述的方法提供了一种简单、相对快速的方法来测量来自新鲜切除的实体瘤标本的线粒体制剂中的线粒体呼吸18。肿瘤由原位植入的小鼠腔体B、ERα阴性EO771乳腺癌细胞19生长。
勤勉和小心地处理组织将大大提高耗氧率的准确性和标准化。如果样品不冷藏，未始终浸没在保存介质中或处理过度，则组织和线粒体很容易受损，从而导致常规和OXPHOS率欠佳。此外，均质组织的准确湿重至关重要，因为这是主要的归一化方法。可以考虑其它归一化方法，例如总蛋白或线粒体特异性标志物，例如柠檬酸合酶活性20。此外，需要解决组织异质性，先验地将肿瘤区域的决定纳入实验 。 坏死、纤维化和结缔组织可能无法均匀化和/或呼吸良好，除非有意测定这些肿瘤区域，否则应避免使用。值得注意的是，根据类型和切除区域的不同，肿瘤可能非常粘稠，这使得准确的称重和转移更具挑战性。应优化用于均质化的笔画次数，以确保线粒体的完全制备，同时减轻对外线粒体膜的损伤。
为了提高准确性和可重复性，我们建议对均质制备的行程次数，组织浓度以及底物，开耦剂，抑制剂浓度进行优化实验。研究可以比较不同的卒中次数以及它们如何与研究中增加细胞色素 c 的反应以及最大线粒体呼吸能力 21的对应关系。虽然人们普遍认为细胞色素 c 反应越少越好，因为添加细胞色素 c 后氧气消耗的增加可能表明对外线粒体膜的损害，但对于每个组织的这个阈值没有金标准，应该通过实验进行研究，以确保组织不会过度劳累或准备不足。在这种肿瘤组织中，发现~30%以下的细胞色素 c 反应不会损害呼吸功能。如果检测结果为阳性，细胞色素 c 的使用对于准确定量呼吸能力至关重要。在这种情况下，添加物补充内源性细胞色素 c， 如果耗尽，将导致呼吸频率的低估。
组织浓度滴定实验可以在一系列可行的浓度上进行，理想情况下，可以使用将在研究期间研究的SUIT进行。呼吸能力因肿瘤类型和组成而异。因此，线粒体密集的肿瘤或高呼吸能力将需要较低的浓度（0.5-5mg / mL）。线粒体少或呼吸能力低的肿瘤需要更高的浓度（7-12mg / mL）。此外，长或具有高消耗底物的SUITs可能需要较少的组织以防止腔室的再氧合或ADP限制。一些组织在氧气消耗方面具有线性关系，而其他组织在一定浓度范围内将显示出更高的灵敏度和最大氧化。应优化所选的组织浓度，以最大限度地提高氧通量，同时限制再氧合事件的次数。此外，通常最好高估需求或瞄准浓度范围的较高端。这些抑制剂对呼吸通量的定量至关重要，当用于较大的线粒体池时更精确。
另一个重要的考虑因素是方案期间使用的药物的浓度。匀浆浓度的变化可能会改变最大响应所需的底物、解偶联剂和抑制剂的浓度。因此，一旦选择了最佳浓度范围，就应该进行实验测试SUIT方案所需的剂量。可以添加额外的ADP，以确保腺苷酸浓度不限于呼吸通路。化学解偶联剂如FCCP或CCCP将抑制较高浓度的呼吸22。因此，必须少量滴定以显示最大达到速率。抑制剂，如鱼藤酮和抗霉素A，最好在第一次注射中饱和时使用。虽然在初步实验中确定了最佳浓度，但我们也观察到了对抑制剂的反应与治疗相关的差异，因此经常添加一次额外的抑制剂注射以证明最大抑制作用，因为结果速率是定量的基础。抗坏血酸/ TPMD的化学抑制对于准确的分析还原至关重要，因为TMPD经历自氧化23。我们通过加入叠氮化钠（一种已建立的CIV抑制剂）来控制抗坏血酸/TMPD/细胞色素 c 的自氧化。对于Km研究，单独在琥珀酸盐存在下添加鱼藤酮可防止草酰乙酸积累，其可以抑制低浓度下的琥珀酸脱氢酶活性24。ADP的体积和浓度高度依赖于线粒体对主要底物组合的敏感性。对ADP高度敏感的线粒体制剂将需要较低的起始浓度。此外，经过验证的化学品和适当的药物制备，注意pH值，对光的敏感性（如果适用）和储存温度对于成功的实验至关重要。
仪器设置和常规护理对于这些实验的成功至关重要。充分和适当地清洁腔室对于生物，蛋白质，抑制剂或开耦剂污染的可重复性和预防至关重要。Clark型电极和O2k系统利用玻璃反应室，这对于依赖耗材的基于板的系统来说是一个显着的成本优势。然而，玻璃室必须大力清洁，并可能在随后的研究中成为抑制剂污染的来源。在洗涤过程中用富含线粒体的标本（例如，孤立的心脏或肝脏线粒体）孵育可以降低实验污染的风险，除了稀释和基于酒精的洗涤程序外，还建议使用。如果进行连续研究，用乙醇和线粒体清洁可最大限度地减少抑制剂污染的可能性。建议在每次实验之前校准氧传感器，以获得相对于当前氧气分压的呼吸的准确测量值。如果多次校准不可行，如果洗涤程序后氧气浓度保持稳定和一致，则每天进行一次校准可能就足够了。
上面概述的程序利用Oroboros O2k仪器，使用先前设计和优化的保存溶液和呼吸培养基25，26，27测量肿瘤组织在肿瘤切除后4小时内的氧气消耗量。此协议中的多个参数可以修改以用于后续应用。仪器设置和校准、用于组织制备的均质器以及最佳均质和腔室氧浓度都可以适应于其他具有氧气监测潜力的仪器。例如，当添加均质时，腔室略微过量填充，因此当腔室完全关闭时，腔室毛细管保持满。这将消耗腔室中的一些氧气，但是通过优化样品浓度，我们可以在确定开始时的氧气水平时考虑这种消耗。或者，在室关闭之前，可以让样品在环境氧气下平衡，但这通常会增加实验开始前的时间并延迟底物的添加。虽然该协议中使用的均质器是广泛可及的，但可以采用其它商业均质技术，例如组织粉碎机或自动均质机28。
此外，组织制备和仪器程序可以与许多不同的SUIT一起使用，通过多种耦合和通路控制状态来研究呼吸控制29。这些SUIT协议已被开发用于测量功能容量，因此，潜在内源性底物的贡献对容量测量没有影响。我们通过减去抗霉素A-鱼藤酮或叠氮化钠不敏感率（如适用）来分析非线粒体耗氧量和/或匀浆的残留消耗量。线粒体可以在BIOPS或类似构建的保存溶液中长时间（>24小时）保持活力，具体取决于组织类型和完整性30，31。可以提前进行研究以确定时间储存限值，因为某些底物的OXPHOS可能具有不同的限制。如果实验不能在组织切除/活检后的几个小时内进行，这是必不可少的。37°C是大多数哺乳动物系统中评估呼吸功能的最佳生理温度。然而，如果测定温度似乎干扰了评估32，则可以在很宽的温度范围（25-40°C）内进行比较研究，以确保足够的响应性。工具性限制可能会限制进行此类研究的能力。
上述方法的主要局限性是1）通过机械均质化对线粒体造成损害的可能性，2）均质制剂中存在ATP酶或其他亚细胞生化物，这些制剂可能会干扰ATP或其他感兴趣变量的同时测定，并且可能需要额外的校正方法或使用抑制剂33，3）评估每个样品的许多样品和/或多个SUIT非常耗时，因为一台仪器一次可以容纳两个实验，并且需要在连续实验之间进行清洁和设置。优化实验和样品的一致制备可以最大限度地减少可能导致数据不一致的实质性线粒体损伤。
与起始材料的数量，分离线粒体的挑战或透化组织的技术挑战相比，该方法相对于现有/替代方法的重要性是可行性的提高。与透化组织相比，匀浆的制备速度更快，氧气没有那么有限，并且更不容易受到人员之间变异的影响。重要的是，几乎所有样品类型都适用于均质制备，从而可以跨组织进行比较分析。高分辨率呼吸测定法是线粒体OXPHOS和ET的金标准测量。该方法在临床前和临床癌症研究中的应用能够将当前的 体外 研究扩展到 离体 研究。此外，它还在临床和诊断环境中提供了潜在的应用。

所有细胞都通过生产和消耗三磷酸腺苷（ATP）（分子能量货币）的需求密切相关。由于细胞突变引起肿瘤的形成，线粒体通过能量产生的多样化来确保生存，这种能量产生通常与非癌性组织有表型上的区别1，2，3。因此，迫切需要对线粒体呼吸功能进行快速和深入的分析，以便于对肿瘤类型，癌症发生，进展和治疗反应进行分类。
切除组织标本的呼吸功能不能完整地进行评估，因为OXPHOS的主要底物不具有细胞渗透性。为了克服这一限制，线粒体可以通过分离，化学透化或机械均质化来制备。长期以来，线粒体分离被认为是评估呼吸功能的黄金标准。然而，它需要大量的组织，耗时，并且产量低，并且可能选择线粒体4的某些部分的偏倚。透化包括机械分离和将组织切片或纤维束暴露于选择性降解质膜的温和洗涤剂5。透化经常用于横纹组织，如骨骼和心肌，因为单个纤维束可以被梳理分开。与分离相比，透化在其天然细胞环境和物理形式5中产生更多的线粒体。透化已成功应用于其他组织，如肿瘤6，7和胎盘8;然而，透化纤维制剂的再现性可能难以克服，由于解剖的一致性和氧的要求，以克服扩散限制9。此外，透化纤维可能不适合某些细胞密集和高度纤维化的肿瘤类型。组织匀浆是通过质膜的机械破坏产生的，并且在线粒体产量和完整性方面与透化纤维相似10。组织均质也最大限度地减少了氧气扩散的局限性，并且可以通过优化机械力11，12来轻松用于组织类型。
在这里，我们概述了一种简单快速的方法，用于量化新鲜切除的实体瘤匀浆中氧化磷酸化（OXPHOS）和电子转移（ET）容量的速率。该协议经过优化设计，可使用Oxygraph-2k（O2k）高分辨率呼吸仪评估新鲜组织，这需要仪器设置和校准的先验知识，但可以使用任何Clark型电极，Seahorse分析仪或读板器进行类似的调整。该协议可以可重复地应用于物种和肿瘤类型，并适用于评估线粒体ET途径的多样性。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#8242;-diphosphate sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3117057001</td>
			<td>Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 50 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab 7.4 software</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>N182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont # 7 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11271-30</td>
			<td>Dumoxel, autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Calipers 150 mm/6 in</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EO771 cells</td>
			<td>CH3 BioSystems</td>
			<td>SKU:&#160;94APV1-vial-prem</td>
			<td>Pathogen Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>&#160;Jackson Laboratory</td>
			<td>Stock #000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>56750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactobionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsyringes</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10023-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygraph-2k FluoRespirometer</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10003-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatine disodium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate (disodium)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W327700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Filter Paper, grade 5</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1005-090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL</td>
			<td>Duran Wheaton Kimble</td>
			<td>357424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5914SC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Safety Scalpel No. 11</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>1029065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Precision Glide Needle 18 G x 1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1mL Slip Tip Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>316060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Very High Fat Diet,&#160; 60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate</td>
			<td>Research Diet</td>
			<td>D12492</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex Watch Glass, 100 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S34819</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analytical determination of mitochondrial function of excised solid tumor homogenates

线粒体通过能量产生、活性氧调节和大分子合成对癌症的发生和进展至关重要。线粒体对肿瘤环境的遗传和功能适应性驱动增殖和转移潜力。DNA和RNA测序的出现消除了评估肿瘤发生遗传介质的关键障碍。然而，迄今为止，评估肿瘤线粒体功能的方法学方法仍然难以捉摸，并且需要技术熟练程度，限制了可行性，最终降低了实验和临床环境中的诊断和预后价值。在这里，我们概述了一种简单快速的方法，使用高分辨率呼吸法量化新鲜切除的实体瘤均质物中的氧化磷酸化（OXPHOS）和电子转移（ET）容量。该协议可以可重复地应用于物种和肿瘤类型，并适用于评估线粒体ET途径的多样性。使用该协议，我们证明患有腔内B型乳腺癌的小鼠表现出有缺陷的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸连锁呼吸和依赖琥珀酸盐通过OXPHOS产生三磷酸腺苷。

初步研究表明，EO771肿瘤的氧化性较低，因此需要高匀浆浓度才能进行充分的O2通量评估。进行优化实验以确定该研究的最佳组织匀浆浓度范围。最初以40mg / mL制备肿瘤匀浆，然后线性稀释。归一化为组织质量的O2通量在各个浓度上是一致的（图1A-D）。观察到40mg / mL导致快速氧消耗并且不适合实验（图1A）。30 mg / mL和20mg / mL的氧气消耗量显着减慢，但在没有底物或ADP的情况下仍然在短时间内迅速下降（图1B，C）。10 mg/mL的浓度产生了最佳的耗氧量（图1D），这将支持更长的90分钟SUIT方案。
SUIT方案用于评估NADH和琥珀酸盐连接的OXPHOS和ET，以及CIV活性（图2A）。在没有ADP的情况下，将丙酮酸和苹果酸盐添加到组织中，以通过NADH驱动泄漏（L）。然后加入饱和ADP以驱动最大NADH连接的OXPHOS（P），然后加入谷氨酸盐。然后加入细胞色素 c 以确保外膜完整性;所有样品中呼吸速率的增加均小于20%（图2B）。鉴于对NADH连接底物的反应非常低，在琥珀酸盐和鱼藤酮的存在下也评估了细胞色素 c 的释放，并观察到最小的细胞色素 c 刺激（图2B）。有趣的是，NADH连接的OXPHOS在EO771肿瘤中可以忽略不计（图2C）。然后在丙酮酸，苹果酸盐和谷氨酸盐的存在下加入琥珀酸盐以刺激电子流经琥珀酸脱氢酶。然后滴定FCCP以驱动最大电子流（E），这表明在EO771肿瘤中，磷酸化而不是氧化限制了呼吸（图2C）。随后对鱼藤酮和抗霉素A进行滴定以分别抑制复合物I和复合物III。然后加入抗坏血酸和TMPD以驱动通过CIV的最大电子流，然后被叠氮化钠抑制。 表1 说明了原始数据的解析还原方程（表2），以定量 图2C中绘制的呼吸参数。总体而言，肿瘤均质呼吸曲线（图2C）与未植入的洋地黄素透化的EO771细胞（图2D）相似，除了肿瘤中N和S连锁底物支持的最大电子转移减少。
由于NADH连接呼吸可以忽略不计，因此通过逐步滴定亚饱和ADP进一步评估琥珀酸盐的呼吸动力学，直到达到最大速率（VMAX）（图3A，3B）。在琥珀酸盐+鱼藤酮存在下ADP的半最大浓度（KM）为37.5μM，而VMAX约为10.5 pmol / s / mg（图3C）。因此，尽管氧化速率相对较差，但EO771肿瘤对ADP高度敏感，并且在相对较低的ADP浓度下持续ATP合成。
选择原始数据的适当区域进行提取对于实验的可重复性和准确定量至关重要。对于细胞色素c，需要在注射前立即在稳态下选择一个标记（图4A，标记1）。通常存在初始注射伪影，随后可能会有一段时间（约5-10分钟），其中O2通量不稳定。一旦O2通量稳定，通过进行额外选择来评估细胞色素c效率（图4A，标记2）。添加底物，ADP或大多数抑制剂后的选择也在注射伪影之后进行，一旦O2通量稳定下来（图4B）。用于确定最大非耦呼吸的选择是在FCCP滴定期间达到的峰值增加时进行的，这通常不是最后一次注射（图4C）。TMPD的选择是在添加抗坏血酸盐和TMPD并且在呼吸增加的峰值时进行的（图4D，标记1）。刚过这个峰值，加入抑制剂叠氮化钠，这会迅速降低呼吸，但也经常具有低于抑制呼吸速率的注射伪影（图4D）。抑制剂标记在注射伪影后立即形成（图4D，标记2）。O2通量通常不会稳定并继续减少。
表1：呼吸表示法和分析推导。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
表2：腔B型乳腺肿瘤均质物的样本和呼吸特性。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg"> 图1：肿瘤匀浆浓度的优化。在（A）40毫克/毫升、（B）30毫克/毫升、（C）2毫克/毫升和（D）10毫克/毫升的乳腺肿瘤匀浆中制备的O2通量（红色）和O 2浓度（蓝色）。Thom：组织均质呼吸。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg"> 图2：通过高分辨率呼吸法评估新切除的肿瘤均质物中的OXPHOS和ET容量。 （A）底物，抑制剂，开耦剂方案过程中氧气消耗量（红色）和浓度（蓝色）的代表性图。PM：丙酮酸+苹果酸盐，D：ADP，G：谷氨酸盐，c：细胞色素c，S：琥珀酸酯，F：FCCP，腐烂：鱼藤酮，Ama：抗霉素A，Asc / TMPD：抗坏血酸/四甲基对苯二胺。（B） 加入细胞色素c后O2通量百分比增加。（C-D）在（C）EO771 衍生的肿瘤匀浆和（D）非植入的 EO771 洋地黄素透化细胞中存在 ADP、FCCP 和抗坏血酸/TMPD 的情况下，由苹果酸盐、丙酮酸盐、谷氨酸盐和琥珀酸盐支持的呼吸。Thom：组织均质呼吸;PM：丙酮酸盐+苹果酸盐;PMG：丙酮酸盐+苹果酸盐+谷氨酸盐;PMGS：丙酮酸盐+苹果酸盐+谷氨酸盐+琥珀酸盐;CIV：复合体IV;-L：泄漏状态;-P：氧化磷酸化状态，-E：电子转移状态;N-连锁：O2通量由定义的NADH生成底物组合支持;NS连锁：O2助焊剂由定义的NADH生成底物组合和琥珀酸盐的收敛性支持。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg"> 图3：EO771乳腺肿瘤显示出较高的ADP（腺苷5′-二磷酸）敏感性。（A） 整个 S 连锁 ADP 滴定方案中氧气消耗量（红色）和浓度（蓝色）的代表性图。Thom：组织均质呼吸;S/腐烂：琥珀酸盐/鱼藤酮;D： ADP。（B） 在鱼藤酮存在下由琥珀酸盐支持的呼吸和增加的ADP浓度（0μM ADP = S / Rot-L）。（C） 在琥珀酸盐 + 鱼藤酮存在下 ADP 的最大速率 （VMAX）和半最大浓度 （KM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg"> 图4：代表性的示踪，说明选择原始O2助焊剂进行数据提取。 （A）细胞色素c选择：细胞色素c注射前的选择号1和注射后选择号2，当O2通量稳定时。c 细胞色素c.（B）底物、ADP和抑制剂选择：选择1后注射（本代表性图中的琥珀酸盐），其中O2通量已稳定。S：琥珀酸盐。（C）开央器选择：选择1号在解耦滴定过程中呼吸增加的峰值。在这个具有代表性的FCCP滴定图中，第三次注射略微降低呼吸，因此不用于选择。女：ACCP。（D）TMPD选择：选择1号在抗坏血酸盐和TMPD注射后呼吸增加的峰值。叠氮化钠选择：急性注射伪影后选择2，当呼吸最初减少时。As/Tm： 抗坏血酸/TMPD;Azd： Azide.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

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Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

我们开发了一种实用的方案和分析方法来评估新鲜肿瘤匀浆中的线粒体氧化磷酸化和电子转移能力。该协议可以很容易地用于调查有助于癌症发生，进展和治疗反应的各种线粒体功能。

分析测定切除实体瘤匀浆物的线粒体功能

Mitochondria are essential to the onset and progression of cancer through energy production, reactive oxygen species regulation, and macromolecule ...

该协议描述了一种用于测量肿瘤线粒体功能的简单而快速的方法。该协议广泛适用于临床转化肿瘤学，并将有助于加强对线粒体在癌症发作和进展中的作用的诊断和机制解释。该技术的主要优点是应用组织均质化来简化制备并最大化线粒体的产量，同时减轻扩散的局限性。该技术在临床和诊断环境中提供了潜在的应用，使用新鲜活检或切除的肿瘤组织对肿瘤线粒体功能进行定量评估。首先将含有一毫升线粒体呼吸培养基或MiR05的玻璃均质机放在湿冰上紧密贴合的玻璃杵中。将组织置于冰冷的培养皿中的一毫升活检保存溶液或BIOPS中。将肿瘤切成每块约5至10毫克的小块，并将剩余的肿瘤块放回10毫升BIOPS中，保存在冰上。在滤纸上小心地擦拭组织切片后，将它们放在一个小的塑料去皮秤上，并记录最初的湿重。将未使用的碎片放回BIOPS的10毫升锥形管中以继续保存。将组织切片浸入含有MiR05的冰冷均质机中，并在称重船上记录剩余重量。使用间隙范围为0.09至0.16毫米的玻璃杵，通过完成五到七次向下和向上的行程来轻轻破坏肿瘤组织。每次击打时，以顺时针/逆时针旋转杵三次，同时向下推动杵，并在将杵拉回时再旋转三次。在两次划水之间，让组织沉降到均质机的底部，但避免将杵完全置于液体体积之上以防止起泡。将匀浆倒入15毫升的锥形管中，并将其放在冰上。将一到三毫升新鲜MiR05移取在杵上，然后放入均质机中，以洗涤任何剩余的组织匀浆。将MiR05洗涤液倒入含有均质物的锥形管中。重复此步骤两到三次，以确保匀浆的完全转移。为了准确计算组织均质浓度，请仔细检查均质机和均质液中剩余的非均质材料，其中包括结缔组织。为了从均质机中除去镊子无法到达的非均质材料，将MiR05加入均质机后，用移液管吸出体积（包括组织），并将内容物移动到培养皿中。通过用移液管吸出锥形管底部大块沉降的非均质材料，将其从均质液中取出，并将它们放在锥形管的盖子上。用镊子从培养皿或锥形管盖中取出组织，并将其擦拭在滤纸上。将剩余的均质物从锥形管盖中重新加入锥形管中。盖上管子，然后倒置混合。重新检查均质器和均质器是否有任何额外的非均质材料，并根据需要重复步骤以去除非均质材料。称重并记录从均质机回收的非均质材料的质量。检查匀浆制剂中是否有任何完全完整的转移组织，并取出非均质片并根据需要称重。从称重船、均质机和均质中减去从初始湿重中回收的组织重量，以计算最终样品重量。使用最终样品重量，添加额外的MiR05以使匀浆达到所需浓度。一旦称量并制备了匀浆，请尽快进行测定。将样品储存在湿冰上，直到转移到仪器上。校准仪器并制备样品后，以扭曲的运动取出塞子，并将MiR05从腔室中吸出，避免膜暴露在腔室内。将匀浆混合均匀，并向腔室中加入2.25毫升匀浆。假设将一种匀浆液添加到多个腔室中，一次将一毫升匀浆移入每个腔室中，同时混合均质以确保均匀的组织分布。单击 F4 以命名事件并为其添加时间戳，然后单击"确定"。使用钝的18号针头将来自氧气罐的氧气填充50毫升注射器，氧气罐带有调节器和气体管。将氧气直接注入腔室中，使其过氧化为约500微摩尔氧。松散地插入塞子并等待关闭，直到氧气达到约480微摩尔。通过扭曲运动，慢慢关闭腔室，让呼吸平衡约15至20分钟。如有必要，用MiR05填充塞子的中央毛细管。使用专用的微量注射器将底物、解偶合器和抑制剂注射到完全封闭的腔室中，以实时命名每个腔室的事件并加盖时间戳。选择 F6 可根据需要调整氧浓度和氧斜率负刻度。每次注射后，将注射器在水中洗涤三次水溶性化合物，70%乙醇洗涤乙醇溶解化合物。加入五微升0.8摩尔苹果酸盐，并立即进行下一次注射。将注射器在水中洗涤三次。立即加入5微升1-摩尔丙酮酸，等待呼吸稳定。清洗注射器后，加入10微升0.5摩尔ADP，等待ADP反应稳定。清洗注射器，加入5微升2-摩尔谷氨酸盐，等待呼吸稳定。清洗注射器，然后加入五微升4毫摩尔细胞色素-C，等待呼吸稳定。清洗注射器后，加入20微升1摩尔琥珀酸盐，等待呼吸稳定。以 0.5 至 1 μL 的 1 毫摩尔 FCCP 为增量滴定，并等待每次注射后呼吸稳定。继续，直到呼吸没有额外增加。将注射注射器在70%乙醇中洗涤三次。加入两微升150微摩尔鱼藤酮，等待呼吸稳定。再加入一微升鱼藤酮，以确保没有进一步的抑制。如果呼吸减少，继续额外注射，直到呼吸没有减少，然后用70%乙醇洗涤注射器三次。加入两微升125微摩尔抗霉素A，等待呼吸稳定。再加入一微升抗霉素A，以确保没有进一步的抑制。如果呼吸减少，继续额外注射，直到呼吸没有减少。用70%乙醇洗涤注射器三次。检查腔室的氧气浓度。如果浓度低于125微摩尔，则向室内空气再加氧，或轻度超氧，以确保氧气不会限制呼吸通量。加入5微升0.8摩尔抗坏血酸盐。将注射器在70%乙醇中洗涤三次。立即加入10微升0.2摩尔TMPD，等待呼吸增加。用乙醇洗涤注射器后，当抗坏血酸TMPD的呼吸通量稳定时，立即加入25微升4摩尔叠氮化钠。通过单击"文件"，"保存并断开连接"来结束。观察到每毫升组织匀浆40毫克导致快速耗氧。氧气消耗量显着减慢，每毫升组织匀浆30和20毫克，但在没有底物或ADP的情况下，仍然在短时间内迅速下降。每毫升浓度为10毫克的组织匀浆导致最佳的耗氧率。使用SUIT方案评估NADH和琥珀酸盐连接的氧化磷酸化和电子转移，以及复合物IV活性。在丙酮酸盐和苹果酸盐或琥珀酸盐和鱼藤酮存在的情况下评估细胞色素C释放，这两者都表明匀浆制剂不会损害线粒体。还发现NADH连接的氧化磷酸化在EO771肿瘤中可以忽略不计。FCCP的滴定以驱动最大电子流显示，在EO771肿瘤中，磷酸化而不是氧化限制了呼吸。肿瘤均质呼吸谱与未植入的、洋地黄素透化的EO771细胞相似，除了肿瘤中N和S连锁底物支持的最大电子转移减少。通过逐步滴定亚饱和ADP直到达到最大速率，进一步评估琥珀酸盐的呼吸动力学。在琥珀酸盐和鱼藤酮存在下，ADP的半最大浓度为37.5-微摩尔，而最大速率约为每秒10.5皮摩尔，每毫克。在常规护理和组织处理中设置的仪器对于这些实验的成功至关重要。遵循这些程序，可以根据感兴趣的问题应用其他质量或标记特异性方法来进行速率归一化。常见的衡量标准包括总蛋白定量和柠檬酸合酶的酶活性，但因模型系统、统计设计和研究问题而异。

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